研究背景食管癌在我国乃至世界范围内都是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一,其病理组织学分类多样,例如鳞状细胞癌、腺癌、未分化癌等,但以下面两种最为多见：食管腺癌、食管鳞状细胞癌。食管癌在我国本身就高发,再加上我国人口基数大,每年新发病例便多,约占全世界新发病例的半数左右,而且可能由于遗传、饮食习惯等原因病理组织学类型分布与欧美不同,其中食管鳞状细胞癌占绝对多数,约占食管癌的90%,造成了极大的经济负担和社会负担。随着内镜技术的发展,有不少食管鳞状细胞癌能够在非常早期便被发现,从而通过内镜下食管粘膜剥离术治疗,另外胸中段食管癌占据多数,分期稍晚的但是有外科手术机会的患者多以进行食管癌根治术+胸腹两野淋巴结清扫术为主,但内镜下食管粘膜剥离术无法对淋巴结进行清扫,而食管癌根治术+胸腹两野淋巴结清扫术无法对可能隐匿的颈部淋巴结进行清扫,术后容易转移和复发,还有很多患者发现时便已错过手术机会,总体5年生存率很低。近些年来,随着科技和社会的进步,分子靶向治疗越来越显示出优势,在一些恶性肿瘤的治疗方面起到了很好的作用。例如应用索拉菲尼对肝癌进行治疗和应用易瑞沙对肺癌进行治疗,极大的改善了肿瘤患者的预后。与食管鳞状细胞癌相关的基因及其产物,在近些年研究的也比较多,但到目前为止,仍然没有能得到临床公认并广泛应用的指标。鉴于以上几点原因,我们认为继续寻找在食管鳞状细胞癌发生及进展过程中有重要作用的因子,并研究其作用机制,可能带来两方面益处：一是如果能够提示某些患者预后差的话可以制定个体化治疗,例如术后联合放疗,另外如果某些基因及产物对癌细胞的扩散有帮助的话可以针对其研究药物进行精准治疗。高迁移率族蛋白A2,简称HMGA2,是一种非组蛋白染色体蛋白,能够通过改变脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)的结构来调节某些基因的转录与表达,作用方式是通过AT-hook结构域与DNA结合,因此又被称为“构筑转录因子”。研究发现HMGA2与机体的生长发育密切相关,在胚胎早期高表达,而在正常成人分化成熟的组织中几乎检测不出。近年来,多项研究发现在一些良恶性肿瘤中存在HMGA2的异常表达,并且HMGA2表达增高往往预示着该肿瘤容易转移和浸润,预后差。随之进一步的细胞学研究发现抑制HMGA2的表达后肿瘤细胞的增殖速度减慢,侵袭能力减弱。以上这些研究提示HMGA2可能在肿瘤的发生及进展过程中发挥一定的作用。食管鳞状细胞癌做为一种常见恶性肿瘤,HMGA2的表达如何,抑制HMGA2表达后食管鳞状细胞癌癌细胞的增殖速度及侵袭能力会有怎样的变化,目前尚没有系统的研究报道。所以我们设计了此项研究,首先对食管鳞状细胞癌及癌旁组织中HMGA2的表达情况进行检测,方法包括Western Blot及免疫组织化学法,其次将癌组织中HMGA2检测结果结合患者的临床病理资料及随访资料进行分析,寻找与食管鳞状细胞癌患者预后相关的因素,然后通过慢病毒转染及RNA干扰的方法抑制HMGA2的异常表达,将HMGA2受到抑制的细胞进行CCK-8法细胞增殖实验及transwell实验,从而研究HMGA2对食管鳞状细胞癌细胞的增殖及侵袭能力的影响,以期为食管鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供一个可供选择的靶点。第一部分食管鳞状细胞癌组织中HMGA2的表达检测及其与患者临床和病理特点之间的相关性研究目的：检测食管鳞状细胞癌患者的癌组织中是否有HMGA2的异常表达,及HMGA2异常表达与患者临床特点和病理特点之间的相关性。方法：在这部分实验中,我们根据入选标准对自2007年10月至2009年9月在山东省立医院胸外科住院并接受经右胸上腹二切口食管癌切除+胃食管右胸顶吻合术(Ivor-Lewis)的胸中段食管鳞状细胞癌患者进行筛选,最终有127例患者达到标准成为研究对象,对以上患者的术后标本进行收集,每位患者留取的标本均包括食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)组织及相应的健康食管粘膜(corresponding healthy esophageal mucosa, CHEM)组织,对两组标本进行HMGA2表达情况检测,方法包括蛋白质免疫印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)方法,将检测结果进行比较。再通过统计学软件SPSS19.0将食管鳞状细胞癌组织中HMGA2表达情况与患者的年龄、性别、肿瘤长度、T分期、组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况用卡方检验的方法进行相关性分析。P<0.05时认为有统计学差异。结果：进行免疫组织化学法检测时,从显微镜下观察,当细胞核内出现黄色或棕色颗粒认为有HMGA2表达。免疫组化评分≥4的样本认为有HMGA2阳性表达。检测结果显示HMGA2阳性表达率在食管鳞状细胞癌组织中是63.3%(72/127),在相应的健康食管粘膜组织中无阳性表达,两组相比有显著差异。卡方检验相关性分析显示与HMGA2阳性表达有相关性的临床及病理特点包括：组织分化程度(P=0.008),T分期(代表浸润深度)(P=0.007),是否有淋巴结转移(P<0.001)、TNM分期(P=0.006)；无相关性的临床及病理特点包括：性别(P=0.291)、年龄(P=0.857)及病变长度(P=0.854)。进一步的蛋白质免疫印迹法检测显示HMGA2的阳性表达率在Ⅲ期和Ⅳ期患者癌组织中显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者癌组织。结论：食管鳞状细胞癌中有HMGA2的高表达,且与HMGA2表达增高相关的临床及病理特点包括：组织分化程度、是否有淋巴结转移、TNM分期及T分期(代表浸润深度),HMGA2可能与食管鳞状细胞癌的浸润能力及临床进展相关。第二部分影响食管鳞状细胞癌患者预后的相关因素分析目的：研究影响食管鳞状细胞癌患者预后的相关因素中是否包括HMGA2的表达。方法：本部分实验中,研究对象仍为2007年10月至2009年9月在山东省立医院胸外科住院并接受经右胸上腹二切口食管癌切除+胃食管右胸顶吻合术(Ivor-Lewis)的胸中段食管鳞状细胞癌患者,通过对患者术后进行定期的随访观察,记录生存时间。统计软件采用SPSS19.0,统计方法包括应用Kaplan-Meier生存曲线绘制总体的生存曲线及HMGA2不同表达组的生存曲线,将收集的临床资料、病理特点以及HMGA2表达情况均进行Log-rank检验筛选出与生存时间相关的因素,再通过Cox回归分析最终筛选出影响患者生存时间的独立危险因素。P值<0.05时认为有统计学意义。结果：结果显示总体5年生存率是19.69%。HMGA2表达阳性组和HMGA2表达阴性组5年生存率差异显著(13.89%vs.27.27%,P<0.001)。通过Log-rank检验得出与生存时间相关的因素还包括：TNM分期、是否有淋巴结转移及组织分化程度。将以上四项进行Cox回归多因素分析后显示影响食管鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素包括：肿瘤TNM分期(P=0.006),组织学分化程度(P=0.003)和HMGA2表达水平(P=0.048)。结论：影响食管鳞状细胞癌患者术后5年生存率的独立危险因素包括：肿瘤组织学分化程度、TNM分期及HMGA2表达水平。第三部分应用RNAi沉默技术观察HMGA2基因对食管鳞状细胞癌Eca109细胞生物学行为的影响目的：应用RNAi沉默技术研究HMGA2对食管鳞状细胞癌细胞系Eca109细胞增殖速度和侵袭能力的影响。方法：在本部分的实验研究中,首先对食管鳞状细胞癌细胞系Eca109中HMGA2的表达情况进行检测,方法包括定量即时聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法,再通过携带HMGA2shRNA的慢病毒和携带NCshRNA的慢病毒分别转染食管鳞状细胞癌细胞系Eca109,从而将细胞系分为三组：HMGA2组、NC组、空白对照组,分别通过定量即时聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法检测三组中HMGA2mRNA和HMGA2蛋白,验证HMGA2组细胞系中HMGA2的表达确实被抑制后进一步通过细胞功能学实验CCK-8法和trans well法来观察抑制HMGA2表达后食管鳞状细胞癌细胞系Eca109细胞的增殖速度和侵袭能力变化。结果：定量即时聚合酶链反应和免疫组织化学法检测结果均显示HMGA2在食管鳞状细胞癌细胞系Eca109中表达增高。应用RNA干扰技术和慢病毒转染技术可以成功构建HMGA2表达的Eca109细胞系,而且该细胞系可以稳定传代,与其它两组比较,CCK-8法实验显示HMGA2表达被抑制后癌细胞的增殖速度减慢,transwell实验显示HMGA2表达被抑制后癌细胞的侵袭能力减弱。结论：食管鳞状细胞癌细胞系Eca109细胞中HMGA2的表达可以通过携带HMGA2shRNA的慢病毒转染来被特异性抑制,HMGA2表达被抑制后细胞的增殖速度减慢,侵袭能力减弱。