鹦鹉热衣原体Taqman实时荧光PCR检测方法的建立

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鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci, Cps)属于衣原体科,嗜性衣原体属,生物学特性介于细菌与病毒之间,具有严格的胞内寄生性,革兰氏染色呈阴性。鹦鹉热衣原体病是由Cps引起的一种人畜共患病,在猪、牛、羊和马等牧畜主要表现为流产,死产,食欲废绝,咳嗽,腹泻等症状;鸽子、火鸡等禽类表现为肺炎、呼吸困难、精神沉郁、死亡等病症;在人则以鸟疫和Reiter综合征为主。鹦鹉热衣原体具有宿主广泛,传播途径复杂等特点,在全球许多国家和地区都有发现,并且随着动物的流动,宠物鸟饲养的增多,鹦鹉热衣原体病不仅没有得到有效控制,反而呈现逐年上升趋势。国内外有关感染Cps病例的报道也是日渐增多。感染鹦鹉热衣原体引起的症状与感染其他衣原体引起的症状差异并不是十分明显,在临床上,快速、准确地诊断该病比较困难。因此建立一套快速准确的诊断方法十分必要。Taqman实时荧光PCR技术是一项比较新的技术,具有快速、灵敏、准确、以及定量等特点,其在Cps预防控制、快速检测与诊断方面都具有重要意义。根据GenBank上已公布的衣原体16S-23S rRNA和MOMP基因序列分别设计Y1和Y2、Y3Taqman实时荧光PCR与C1和C2检测用常规PCR。根据以上两个目的基因分别设计X1和X2测序用常规PCR。以鹦鹉热衣原体阳性核酸与水为对照进行试验,结果显示:Y1和Y2检测曲线优于Y3检测曲线。经反应条件与体系优化,对鹦鹉热衣原体与猪鼻支原体、肺炎支原体、鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体等4支原体,以及大肠埃希氏菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌、金色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、霍乱弧菌、副溶血型弧菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、甲型溶血型链球菌、阪崎氏肠杆菌等11种细菌进行对比扩增试验,发现两套Taqman实时荧光PCR具有良好的特异性;双链DNA灵敏度检测结果显示:Y1和Y2实时荧光PCR的检测下限分别是7个拷贝和2个拷贝的双链DNA,比检测用常规PCR灵敏度分别高130倍和5000倍。衣原体基因组灵敏度检测结果显示:Y1和Y2实时荧光PCR比检测用常规PCR灵敏度均高1000倍。由此证明两套Taqman实时荧光PCR灵敏度比常规PCR高。X1和X2测序用常规PCR扩增三株Taqman实时荧光定量PCR检测呈阳性的鹦鹉热衣原体,产物经DNA测序比对,结果显示该三个样品是鹦鹉热衣原体。此结果证明建立的Y1和Y2Taqman实时荧光PCR检测方法具有快速、高效、特异和灵敏的特点,可用于鹦鹉热衣原体样品的检测。
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