偏硅酸钠对高血脂家兔外周血白细胞活性氧产生的影响

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目的:以往动物实验证实偏硅酸钠(Na2SiO3)具有抑制动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的作用,本文观察Na2SiO3对ox-LDL刺激的健康家兔外周血白细胞以及高脂血症家兔白细胞产生ROS的影响,为Na2SiO3抗AS机制提供进一步资料。方法:第一部分1低密度脂蛋白的分离、氧化和鉴定采用化学沉淀法提取低密度脂蛋白(LDL)。将LDL置于10μmol/L CuSO4溶液中,37℃避光氧化24h,经PH7.4 PBS透析24h,过滤除菌,得ox-LDL,4℃保存。琼脂糖凝胶电泳鉴定,考马斯亮蓝法测定浓度。2白细胞悬液的制备及分组抽取健康家兔外周血,加入到事先准备好的3.8%的枸橼酸钠中(两者体积比为9:1),混匀得抗凝血。加入等体积的Hank’s液,混匀备用。另取玻璃试管,各加入2倍于血体积的淋巴细胞分离液。将上述混合液缓慢加到淋巴细胞分离液上,2000转/分离心20分钟。血细胞被分成4层,小心取出单个核细胞层和中性粒细胞层,混匀即得白细胞悬液。加五倍于白细胞悬液的Hank’s液,充分混匀后,以2000转/分离心15分钟。吸去上清液,沉淀洗2次即得所需白细胞。得到的细胞经瑞士染色检测白细胞纯度95%以上,台盼蓝染色检测细胞存活率95%以上。分别设正常对照组、ox-LDL组、68.5mg组、34.2mg组、17.1mg组、8.5mg组。第二部分1动物分组12只健康雄性新西兰大白兔随机分为对照组,高脂组,Na2SiO3组。2指标检测分离外周血白细胞后检测加或不加刺激物条件下的ROS。扫描电镜观察各组白细胞形态变化。提取白细胞总RNA,运用RT-PCR的方法,检测CD36,TLR4,TLR2及gp91phox mRNA的表达。结果:第一部分1 LDL的提取和氧化结果化学沉淀法所得LDL的琼脂糖凝胶电泳显示为单一条带,与正常血清中LDL条带处于同一水平。LDL氧化产物琼脂糖凝胶电泳显示为单一条带,泳动速率较LDL快近一倍,提示LDL的提取及氧化成功。2 Na2SiO3对ox-LDL刺激白细胞ROS的影响单纯加Na2SiO3对正常家兔外周血白细胞ROS的生成无显著影响(P >0.05);ox-LDL组与正常对照组相比ROS增多(P <0.01);8.5mg组与ox-LDL组相比白细胞ROS产生减少(P <0.01),其余三个Na2SiO3浓度组与ox-LDL组相比ROS无显著差异(P >0.05)。第二部分1 Na2SiO3对高脂组家兔外周血白细胞ROS的影响饲养动物4周后,高脂组和Na2SiO3组血浆胆固醇均显著高于对照组,但是两组之间没有显著区别。高脂组白细胞ROS的生成量比正常对照组增加(P <0.01),Na2SiO3组比高脂组ROS生成量减少(P <0.01)。2白细胞扫描电镜的观察结果2.1正常对照组白细胞镜下可见白细胞表面结构清晰、典型,背景干净。粒细胞表面有光滑饱满的大小不一的球状突起,且表面干净,没有物质粘附。淋巴细胞表面有较低平的凹凸,无微绒毛;单核细胞,其表面有许多明显的皱褶和不规则的突起。2.2高脂组白细胞镜下可见白细胞表面被脂质覆盖,背景模糊不清,细胞体积缩小,明显变形,表面结构不清,细胞间粘附性增强。2.3 Na2SiO3组白细胞镜下可见白细胞形态结构明显恢复正常,背景干净,细胞表面脂质沉积少见,形状饱满,皱褶清晰,无粘附现象。并可见白细胞基底附着面形成多条锥形伪足伸向四周。3细胞CD36,TLR4,TLR2及gp91phox mRNA变化高脂组单个核细胞及中性粒细胞CD36、TLR4、TLR2和gp91phox的mRNA均比对照组显著增加(P <0.01),Na2SiO3组这四种基因的mRNA均显著下调(P <0.01)。结论:Na2SiO3对ox-LDL刺激健康家兔外周血白细胞产生ROS有抑制作用;饮用Na2SiO3可以下调高脂血症家兔外周血单个核细胞和中性粒细胞CD36、TLR4、TLR2及gp91phox mRNA水平、抑制其引爆和激活,Na2SiO3的这种作用不通过降低血脂而实现。
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