肾综合征出血热（HFRS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属（Hantaviruses，HV）病毒引起的急性传染病。是以发热、出血、肾脏损害为主要临床特征的自然疫源性疾病。该病的疫源地遍及世界五大洲，我国是世界上受HFRS危害最严重的国家，在我国HFRS的防治是一项十分艰巨的任务。HFRS的防治特别强调“三早一就”（早休息、早诊断、早治疗和就地治疗），许多患者因不能及时确诊而延误治疗，导致病情加重甚至死亡。因此对病人的早期诊断尤为重要。 目前在实验室诊断方面，血清抗体的检测仍然是国内HFRS实验诊断的常用方法，主要有IgM抗体捕获ELISA（Mac-ELISA）和间接免疫荧光（IFA）试验。但血清抗体的检测对于不足5病日的HFRS患者仍有较多的假阴性，使早期抗病毒治疗难以实施。RT-nested PCR虽然可以直接检出血清标本中的HV RNA，但是由于早期患者血清中病毒载量较低及受检测的敏感度所限，该方法目前还难以应用于临床检 第四军医大学学位论立一 测。为此，本研究尝试建立了一种较常规RT－PCR方法敏感的微孔板杂 交方法，并将其应用于临床标本的检测。研究的内容和结果如下： 工．总RNA的提取应用S i gtna公司试剂，全部过程仅需70分钟， 且均在一个Eppendorf管中操作，并直接在原管中进行反转录，可以 最大限度地利用所提取的RNA，并可减少污染。 2．建立RT－nested PCR方法，对98例HFRS患者血清（经临床 和 IFA 确诊）进行检测，阳性率分别为 71．8％（＜7 天）、62．80（8－ 14天）、33．3％（5－21天）和 0（322天），总阳性率为 59．2％ 3．对PCR产物进行限制性酶切分型，结果48例患者中，PCR产 物酶切分型 4 7例为 1型，仅有 1 例为＊型。说明西安地区 H F R S 的 病原以 HTNV为主，这与流行病学调查报道（I型占 99．13％）相符。 4．利用双标记内引物进行RT－PCR 扩增后，对产物进行酶兔疫检 测，阳性率分别为：85．7％（＜7天）、79．l％（8－14天）、78．6％（15－ 21天）和 66．7％（Z22天），总阳性率达SO．6％。PCR产物行琼脂糖电 泳阳性者，酶免检测均阳性，符合率达100％。 5．对 5份正常人、2份非HFRS发热病人和 3份乙肝病人血清进 行微孔板杂交检测，结果均为阴性。证实该方法对于HFRS 的早期实 验诊断具有较高的敏感性和特异性，是可替代RT－PCR 的较理想的方 法。 6．对 108份临床确诊 HFRS患者血清标本进行微孔板杂交分析， 结果阳性率分别为：87．2％（＜7天）、83．7％（S－14天）、73．7％（15－ ZI天）和 57．1％（Z22天），总阳性率达sl．5％，琼脂糖电泳阳性者， 微孔板杂交均阳性，符合率达100儿 证明微板杂交法检测患者血清中 HV RNA的敏感性和特异性高于常规RT－PCR方法，可以用于HFRS患 者的早期实验诊断。