目的1.采用现代色谱分离技术,从独一味药材中分离富集环烯醚萜苷类单体化合物。2.研究独一味环烯醚萜苷类单体化合物的止血活性,筛选有效止血活性单体成分。3.研究有效止血活性单体成分对小鼠凝血系统和纤溶系统的影响,初步探讨活性成分的止血机理。4.建立独一味不同制剂中山栀子苷甲酯的HPLC测定方法,为有效控制独一味制剂的质量提供方法学依据。方法1.采用聚酰胺、大孔吸附树脂柱及反相制备高效液相色谱从独一味药材中快速分离制备环烯醚萜苷类单体化合物。采用硅胶层析柱纯化,共得到四个纯度和含量均较高的单体化合物,包括：8-0-乙酰山栀子苷甲酯、番木鳖苷、PhloyosideⅡ和山栀子苷甲酯。2.各环烯醚萜苷单体化合物经小鼠尾静脉注射给药后,采用毛细管凝血实验、小鼠摘眼出血量等实验评价其止血活性,并筛选出止血活性最好的单体化合物。3.活性单体化合物止血机制研究。小鼠尾静脉注射给药后,取血浆对其内源性、外源性凝血指标及纤溶系统相关指标进行测定,研究活性成分的作用环节及止血机制。4.建立独一味制剂的山栀子苷甲酯测定方法,采用梯度洗脱法,用反相高效液相色谱法(HPLC)测定独一味制剂中山栀子苷甲酯的含量,为有效控制独一味制剂质量提供参考。结果1.利用反相制备液相色谱结合反相高效液相色谱,在经试验优选所确定的洗脱和检测条件下,分离富集得到4个含量较高的环烯醚萜苷单体化合物。经由对照品液相色谱保留时间比对及质谱(MS)、核磁(NMR)分析分别确定为8-O-乙酰山栀子苷甲酯(8-O-acetyl-shanzhizide methyl ester)、山栀子苷甲酯(shanzhiside methyl ester)、番木鳖苷(loganin)和PhloyosideⅡ。2.小鼠毛细管凝血试验(CT)和摘眼球出血量试验结果表明,8-O-乙酰山栀子苷甲酯能显著缩短小鼠毛细管凝血时间,同时也能有效减少小鼠摘眼出血量,且呈现剂量依赖性,表现出良好的止血活性。3.对于凝血系统,小鼠血液凝集参数测定结果表明,与正常对照组相比,8-O-乙酰山栀子苷甲酯高、中、低三个剂量组对小鼠血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)均无影响,但均能提高血浆FIB含量,具有剂量依赖性。4.对于纤溶系统,纤维蛋白溶解活性试验结果表明,与正常对照组相比,8-O-乙酰山栀子苷甲酯高、中、低三个剂量均能显著延长小鼠简易蛋白溶解时间和优球蛋白溶解时间,其中高剂量效果最佳,并显示出良好的剂量依赖性。纤溶酶和FDP酶联免疫法试验结果显示,8-O-乙酰山栀子苷甲酯在200 mg/kg剂量下可显著抑制小鼠血浆纤溶酶活性,并能降低血浆FDP含量。5.市售独一味制剂HPLC测定结果显示,山栀子苷甲酯在9.6-115.2μg/ml范围内浓度与峰面积呈良好线性关系；平均加样回收率为97.69%。从市售独一味制剂中均检测出山栀子苷甲酯,但含量差别较大；且这种差异与课题组前期测定的8-O-乙酰山栀子苷甲酯含量基本类似。结论1.采用反相制备液相色谱可以实现独一味总环烯醚萜苷中4个主要单体化合物的富集分离,且方法操作简便,分离效率高,是一种新型、高效的环烯醚萜苷单体成分制备方法。2.止血药效学筛选试验表明8-O-乙酰山栀子苷甲酯具有很好的止血活性,有着良好的开发利用价值。3.8-0-乙酰山栀子苷甲酯对小鼠凝血系统无明显影响,但可抑制纤溶系统活性,其止血机理主要是通过抑制纤溶过程,可能为抑制纤溶酶活性,但对于纤溶系统的具体作用靶点尚需进一步研究。4.本实验所建立的独一味不同制剂中山栀子苷甲酯及前期试验建立的8-O-乙酰山栀子苷甲酯的反相高效液相色谱法(HPLC)测定方法简便、准确、重现性好、专属性强,适用于独一味不同制剂中山栀子苷甲酯和8-O-乙酰山栀子苷甲酯的含量测定。结合抗炎、止血药效学和分析实验结果,作者认为以山栀子苷甲酯和8-O-乙酰山栀子苷甲酯为参照对独一味制剂进行质量控制具有一定的可行性。此外,实验室建立的独一味及其制剂中山栀子苷甲酯和8-O-乙酰山栀子苷甲酯的HPLC方法得到中国药典委员会的认可,被列入2010版《中国药典》。