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目的:基于鼠白血病细胞(L615和L1210),建立一种能够表达hCD4/CCR5/cyclinT1的跨物种感染HIV-1的细胞模型。人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是一种感染人体免疫系统细胞,破坏和损伤其功能,最终导致获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)即艾滋病发生的病原体。艾滋病自1981年第一次报道以来,作为一种公共卫生和社会问题,就一直危害着人类的生存和发展。HIV具有很强的物种特异性,这导致,在非人灵长类动物中采用嵌合的猴-人免疫缺陷病毒(simian-human immunodeficiency virus,SHIV)进行细胞与动物模型的制备;在鼠类中,仅能通过选择重症联合免疫缺陷鼠(severe combined immunodeficiency,SCID),移植人类组织细胞实现HIV-1的感染而进行动物模型的制备。为实现HIV-1跨种族于鼠细胞的HIV-1入胞感染以及病毒的完整复制的细胞模型,而设置本课题研究。方法:首先,应用Gateway技术,构建慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP/Neo-CMV>hCD4:T2A:hCCNT1:IRES:hCCR5,经核苷酸测序分析确认目的基因无误后进行慢病毒表达载体包装;将制备的慢病毒载体感染293T细胞,采用qRT-PCR检测293T细胞中hCD4、hCCR5和hCyclinT1基因在mRNA水平的表达情况,以明确制备的慢病毒载体hCD4/CCR5/CyclinT1基因表达情况。然后,将加载hCD4/CCR5/cyclinT1的慢病毒载体以最佳感染复数感染L615及L1210细胞,提取L615及L1210的RNA和蛋白质用实时荧光定量PCR(RT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)、免疫荧光法检测L615及L1210细胞中hCD4、hCCR5和hCyclinT1的表达率。最后,对转基因的L615及L1210进行HIV-1感染,通过RT-PCR检测细胞培养上清液及胞体中的HIV-1RNA,验证hCD4/CCR5/cyclinT1转基因小鼠细胞对HIV-1感染的敏感性。结果:核苷酸测序结果表明hCD4、hCCR5和hCyclinT1均已正确地插入到质粒载体中;通过荧光显微镜可以直接观察到由EGFP标记的慢病毒载体;qRT-PCR结果实验结果表明,与空载慢病毒相比,基于表达hCD4/CCR5/cyclinT1分子的慢病毒载体的hCD4、hCCR5和hCyclinT1基因在mRNA水平的表达量相当高,这表明基于表达hCD4/CCR5/cyclinT1分子的慢病毒载体是成功构建的。L615及L1210细胞经慢病毒载体转染后,qRT-PCR结果说明这两种细胞可以阳性表达h CD4、hCCR5和h CyclinT1mRNA;Western blot检测结果显示L615及L1210细胞中hCD4、hCCR5和hCyclinT1蛋白的表达;免疫荧光的结果表明hCD4、hCCR5和hCyclinT1是可以在L615及L1210细胞膜上表达的。以上研究结果证实,慢病毒载体可将外源基因转入细胞,通过慢病毒载体介导hCD4/CCR5/cyclinT1进入L615和L1210细胞是可行的。转基因的L615及L1210感染HIV-1后,RT-PCR结果发现在两种细胞系的培养上清液及胞体中都检测到HIV-1RNA,说明在感染表达hCD4/CCR5/cyclinT1的慢病毒后,L615及L1210可以支持HIV-1的入胞感染及在细胞内的有效病毒复制。结论:本实验建立了能够支持HIV-1入胞感染、并实现病毒复制的小鼠白血病细胞模型(L615和L1210),本研究的小鼠细胞模型还可以进一步促进HIV-1感染的鼠类动物模型研究与制备。跨物种的鼠类的HIV-1感染的细胞与动物模型,可为HIV/AIDS的发病机制、疫苗制备和潜在的抗病毒药物的研究提供一个新的平台。