光学显微镜以及荧光显微镜的特异性,非侵入性以及能够进行活细胞多色成像等特性,使其在生物学研究中具有很重要的作用。同时由于光具有的衍射特性,光学成像设备都存在分辨率极限。对于光学显微镜来说,分辨率在侧向能够达到200nm,轴向达到500nm左右。而近年来发展的超分辨显微成像技术能够突破传统荧光显微镜的衍射极限限制,分辨率达到几十纳米甚至几纳米范围,拓展了荧光显微镜在细胞显微结构,相关蛋白分布以及相互作用的相关研究中的应用。超分辨显微镜在近几年取得了很大成功,与此同时如何得到更高的空间以及时间分辨率成为接下来的研究方向。本文在超分辨显微技术的基础上,介绍了在硬件以及软件方面进行的技术改进工作,包括：第二章中介绍了单分子荧光干涉测量超分辨显微成像系统。通过利用单分子荧光干涉测量的方法达到提高单分子轴向定位精度的目的。对于荧光成像技术来说,三维成像能够得到细胞内结构的更多信息。通常对于光学显微镜以及超分辨显微成像技术而言,能够达到的轴向定位精度通常低于侧向定位精度。现在常用的单分子轴向定位方法包括双层成像法,柱面镜法以及DH-PSF系统。这些方法都是通过改变点扩散函数的形状来达到对Z轴位置进行定位的目的。另外还有使用荧光干涉测量方法的iPALM和4Pi-SMS等方法,通过使用双物镜以及荧光干涉的方法达到更高的轴向定位精度。但是这两种方法系统结构复杂,成本较高,国内还没有实验室建成类似的系统。我们通过比较几种显微技术,设计并搭建了单分子干涉成像显微镜,称为piPALM。我们在系统中通过使用通用部件降低了系统成本,在保持了荧光干涉的轴向高定位精度特性的同时,使得搭建过程更简单。在第二章中详细介绍了系统的软硬件开发以及搭建调试过程。成像结果表明,我们的系统能够实现单分子荧光干涉测量轴向位置,在三维方向上都能够达到20nm以下的分辨率。第三章主要介绍了对受限运动状态的单分子进行建模并分析其运动状态对定位精度的影响。同时开发了基于人工神经元网络算法的单分子定位算法,能够消除单分子点扩散函数不对称性对定位精度的影响,具有更高的鲁棒性以及计算速度。对于单分子定位超分辨显微技术来说,单分子定位方法具有很重要作用。常用的单分子定位算法包括最小二乘法以及极大似然法。这两种方法在拟合计算时使用的模型都是二维高斯函数。当单分子的运动受限制或者完全固定时,它的图像会变得不对称,这时使用高斯函数作为拟合模型进行拟合就会产生很大的定位误差,而离焦时会造成更大的定位误差。在本文中,我们首次提出了限制运动偶极子模型以及理论点扩散函数。其次,由于理论点扩散函数的数值计算过程很复杂,不适合使用传统的拟合算法进行参数估计,我们在人工神经网络算法基础上开发了单分子定位算法,在保持较高的精度的同时实现了更高的计算效率。对模拟数据和细胞样品数据的分析结果表明,我们方法的定位误差受单分子运动状态以及离焦等情况的影响小于传统的单分子定位算法,能够有效减小因为单分子运动状态以及离焦等因素导致的定位误差,实现更高的单分子定位精度。第四章主要介绍了高密度单分子数据分析方法,通过将压缩感知算法与双层面成像技术的结合,实现了高密度单分子三维定位分析,同时减小了图像采集时间。基于单分子定位的超分辨显微技术能够达到很高的分辨率,但是由于成像原理的限制,需要收集到足够的单分子进行图像重构,因此样品成像的时间较长,通常实验中成像时间几分钟到几十分钟左右。减少图像采集时间的方法之一就是提高每一帧图像中的单分子数量,但单分子密度的提高会使得单分子之间发生重叠。通过比较几种常用的高密度单分子图像分子方法,包括DAO-STORM和压缩感知算法,发现压缩感知算法的性能最好。同时为了实现三维单分子定位而又不影响单分子图像的形状,采用了双层面成像技术来实现Z轴定位。模拟数据以及细胞样品的成像数据分析显示,我们的算法能够达到10μm-1的单分子密度,同时分辨率能够达到50nm。重构一幅图像只需要300帧原始图像,将采集时间缩短到了6秒以下。本文分别讨论了使用硬件以及软件的方法提高超分辨显微技术的轴向,侧向以及时间分辨率的方法原理,实现过程以及分析结果。在实际使用中,空间分辨率与时间分辨率之间会相互影响,在实际使用过程中就需要根据研究需要找到它们之间的最佳平衡点。本文中讨论的三个部分工作都是围绕着超分辨技术展开,扩展了超分辨显微技术的应用范围。