婴幼儿血管瘤是婴幼儿时期最常见的良性肿瘤之一。目前发病机制不清，且对其治疗国内外尚无统一治疗标准。婴幼儿血管瘤的研究尚处于初级阶段，最初研究标本大多来源于组织病理学；如今对婴幼儿血管瘤的研究多倾向于细胞分子以及生物分子学，原代细胞培养是毋容置疑是进行各水平研究的基础。尿素作为临床治疗婴幼儿血管瘤的常用药物，然而，基础研究甚少，故本次研究将在细胞水平上观察尿素对血管瘤内皮细胞作用后的生物学特性以及凋亡。　　目的：　　1. 寻找更高效的婴幼儿血管瘤血管内皮细胞在体外的培养方法，为婴幼儿血管瘤发病机制以及药物治疗婴幼儿血管瘤机制的研究提供基础的科研保证。　　2. 检测不同浓度和剂量的尿素在体外对人血管瘤内皮细胞增值抑制与凋亡的影响，为进一步探讨尿素治疗婴幼儿血管瘤的分子机制研究提供基础理论依据。　　方法：　　1. 选取增殖期婴幼儿血管瘤手术的新鲜标本，采用组织块贴壁法与酶消化法结合进行原代培养，待细胞生长至单层细胞且铺满培养瓶80%时进行传代；取二代细胞进行流式细胞分选，将筛选出CD31阳性的细胞继续培养。每日进行细胞形态学观察其增值特征并绘制其生长曲线，并采用CD31、VWF血管瘤血管内皮细胞表面标记物进行免疫荧光鉴定及流式细胞学鉴定。　　2. 取体外培养人的血管瘤内皮细胞株（HemECs）和正常内皮细胞株(VE)进行培养，采用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，置入5%CO2培养箱进行培养，在细胞达对数生长期时，经不同浓度和剂量的尿素进行干预后，通过细胞增殖-毒性检测法（cck-8法）分别检测HemECs和VE两种细胞的细胞活力及抑制率；并采用Annexin V-FITC/PI双染通过流式细胞仪检测血管瘤内皮细胞的凋亡率、免疫荧光观察血管瘤内皮细胞在尿素干预后线粒体与Cty-c的表达以及PI染色法通过荧光显微镜观察人血管瘤内皮细胞在尿素作用下的凋亡情况。　　结果：　　1. 培养48-72小时清晰可见组织块周围细胞游出，细胞核清晰，细胞呈长梭形及多边形，2周左右部分可形成“血管腔样”结构，20天可铺满瓶底或达到80%以上时进行传代；细胞流式测定CD31阳性率、VWF与CD31双阳率均在90%以上，免疫荧光染色CD31、VWF单染与共染均呈阳性表达。　　2. 1) 随着尿素的浓度和剂量增加，HemECs和VE的活性逐渐降低；HemECs各实验组与对照组的细胞活力（100±0.049%）差异均有统计学意义P＜0.05；3μl VE实验各浓度组与对照组的细胞活力（100±0.09%）差异性均无统计学意义P＞0.05；6μl、9μl VE各浓度实验组与对照组的细胞活力相比差异性均有统计学意义P＜0.05。在相同浓度、剂量的尿素作用下HemECs与 VE的细胞活力相比差异性有统计学意义P＜0.05，说明低剂量（3μl）40%尿素对血管瘤治疗安全有效;　　2) 由前面结果已知40%尿素可引起血管瘤内皮细胞生长抑制而对正常内皮细胞无影响，因此我们采用40%浓度的尿素作用于血管瘤内皮细胞测定其生长抑制率。结果显示：相同剂量下尿素对HemECs抑制率并不是随着时间的延长而逐渐升高，以4h、12h组抑制率相对较高；相同暴露时间下随着尿素剂量的增加对HemECs抑制率随之升高，各组之间差异均有统计学意义P＜0.05；但3μl/2h、24h、48h与对照组相比差异无统计学意义P＞0.05，24h与48h在各剂量组差异均无统计学意义P＞0.05，40%尿素作用最佳时间是24h以内。　　3) 采用不同剂量的40%尿素作用于血管瘤内皮细胞观察线粒体与Cty-c的表达及细胞凋亡情况。对照组：细胞形态未发现异常，线粒体呈绿色，细胞核呈蓝色， Cty-c呈阴性。实验组：细胞形态不同程度改变，呈多边形、不规则形且大小不一；细胞数量减少，细胞核缩小，形态分布不均。线粒体与Cty-c共染呈淡黄色，细胞核呈蓝色，线粒体呈绿色，Cty-c呈红色。　　4) 同样采用40%尿素作用于血管瘤内皮细胞在不同剂量和作用时间下检测细胞的凋亡情况。结果显示：在同等条件下血管瘤内皮细胞与正常血管内皮细胞的凋亡率随药物剂量增加和时间的延长而升高；小剂量（3 μl）各时间组（6、12、24、48h）的血管瘤内皮细胞凋亡率与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）；6 μl和9 μl在作用6h时与对照组相比凋亡率差异性均无统计学意义（P＞0.05）、且组内比较凋亡率差异性无统计意义（P＞0.05），6、9 μl组在作用12、24、48h时与对照组比较凋亡率差异性均有统计学意义（P＜0.05）、且组内比较凋亡率差异性均有统计学意义（P＜0.05）。结果表明：小剂量（3 μl）40%尿素对血管瘤内皮细胞与正常血管内皮细胞凋亡影响不显著；而大剂量40%尿素可显著促进血管瘤内皮细胞凋亡，且凋亡率明显高于正常血管内皮细胞，血管瘤内皮细胞与正常血管内皮细胞凋亡率差异性比较有统计学意义（F=19.65，P＜0.001）。　　5) 由前面结果已知40%浓度的尿素在小剂量下（3μl）不引起血管瘤内皮细胞凋亡，而大剂量（9μl）会引起血管瘤内皮细胞凋亡，故采用大剂量40%尿素（9μl）的尿素作用血管瘤内皮细胞检测凋亡。结果显示：红色为PI阳性，反之阴性。对照组阴性，实验组强阳性，以12h荧光最强；表明大剂量40%尿素可使HemECs凋亡增加。　　结论：　　1. 成功培养出婴幼儿血管瘤内皮细胞并通过组织块与消化结合法经流式分选后获得高纯度的内皮细胞，为下一步研究婴幼儿血管瘤增生消退机制奠定了基础。　　2. 小剂量40%尿素对血管瘤内皮细胞的增殖有明显的抑制作用、对正常血管内皮细胞无明显作用，而大剂量尿素能促使人血管瘤内皮细胞凋亡。本研究不仅能为进一步探讨尿素对血管瘤内皮细胞作用机制奠定基础，而且为临床上更好安全有效的使用尿素治疗血管瘤提供基础理论依据。