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瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB),是世界范围内的细菌性检疫病害,通过种传严重为害如西瓜、甜瓜等葫芦科作物,在世界各国的西、甜瓜产区普遍发生,并造成严重的经济损失。BFB的病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli),革兰氏染色阴性,单根极生鞭毛,最适生长温度24~28℃,能够通过III型分泌系统(TypeⅢsecretion system,T3SS)将效应子(effector)直接注入到宿主细胞体内。目前,仍没有针对BFB的商品化的抗病品种。转录后水平的调控对于基因的表达、蛋白的正常装配、生命活动的维持具有重要意义。Hfq为RNA伴侣蛋白,能够同小型非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA)一起对基因转录后水平做出调控,促进或抑制靶标mRNA的翻译。而MiaA是tRNA异戊烯焦磷酸转移酶,能够在促进翻译保真度方面发挥关键作用。此外,翻译阶段为了合成有效的多肽,需要额外的核糖体相关蛋白,HflX便是其中之一。编码HflX的基因位于hfq基因下游,能够编码GTP结合蛋白,利用GTP的水解可以驱动其他相关蛋白的功能循环。本实验通过对hfq、miaA、hflX基因进行生物信息学分析,了解了其在西瓜噬酸菌中的基因信息,为了研究基因的功能,通过三亲及同源重组交换构建了miaA、hflX基因的缺失突变菌株,并进行了基因的回补,获得了互补菌株,同野生菌株Aac5进行了各项表型的测定,并利用qRT-PCR测定了hfq、miaA、hflX三者之间可能存在的调控关系。此外,利用生物信息学预测及构建hfq过表达菌株,检测了西瓜噬酸菌中可能存在的Hfq依赖性sRNA,对其在压力环境下的表达量测定之后,选取候选sRNA NC-27在基因组中对其进行了敲除及回补,研究了其在西瓜噬酸菌中的功能并对其靶标mRNA做出了预测。结果如下:(1)通过生物信息学分析发现,西瓜噬酸菌中hfq基因所编码的Hfq蛋白含83个氨基酸,无特殊结构域,能够作为RNA伴侣蛋白行使功能;MiaA蛋白由350个氨基酸组成,具有两个低复杂度域和一个IPPT结构域,它可以催化反密码子附近腺苷的修饰;HflX由390个氨基酸组成,具有两个GTP结合结构域和一个Feo_B结构域。通过蛋白互作关系的预测后发现,Hfq、MiaA、HflX三者可能存在互作关系。(2)miaA、hflX的缺失均降低了西瓜噬酸菌对寄主的致病能力。miaA的缺失,使得西瓜噬酸菌Aac5的三型分泌系统关键基因hrpX显著下调,致病力及生物膜形成能力显著下降,褐色素分泌增多,但未影响其引起烟草过敏性反应的能力。而hflX基因的缺失,同样未对西瓜噬酸菌Aac5菌株引起烟草过敏性反应的能力产生影响。尽管表现出了更强的生物膜形成能力,但是运动能力却显著下降,同时,三型分泌系统关键基因hrpG、hrpE显著下调,其致病能力也显著下降。(3)miaA、hflX同hfq之间存在调控关系。经qRT-PCR测定后发现,hfq基因受到hflX、miaA基因正向调控,hflX基因受到miaA基因正向调控,miaA基因受到hflX基因负向调控。(4)在西瓜噬酸菌中预测到了31个sRNA,其中6个候选sRNA的稳定性依赖于Hfq蛋白。使用SIPHT在西瓜噬酸菌AAC00-1中预测到了31个潜在的sRNA,使用hfq过表达菌株的cDNA进行real-time PCR后发现,其中有6个sRNA的表达量显著上调,即这些sRNA的稳定性依赖于Hfq蛋白。在不同压力环境下,候选sRNA的表达量有所不同。(5)候选sRNA NC-27的缺失,增加了西瓜噬酸菌Aac5的致病能力。NC-27的缺失,增加了hrpG mRNA积累,致使T3SS蛋白HrpG增多,而作为hrpX的上游调控因子,其增多也导致了hrpX mRNA乃至HrpX的上调表达,同时,装置蛋白HrcJ也大量增加,使得其致病力增强。(6)使用Target RNA2在西瓜噬酸菌中共预测到了候选sRNA NC-27的29个靶mRNA,通过对NC-27的二级结构分析后发现,其在3’端具有一段富含尿嘧啶(U)的序列,能够同Hfq蛋白内圈氨基酸接触,而同候选靶mRNA的结合位点主要位于102~117核酸之间。