血小板/T活化抗原1（Platelet and T cell activation antigen 1，PTA1）是1997年基因克隆成功的一个新分子，并在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组大会上给予了新的CD编号为CD226。自1985年发现该分子以来，对其结构、分布、功能以及与临床疾病的关系等做了大量的研究。结果证实，PTA1分子属于免疫球蛋白超家族成员，胞膜外含有两个免疫球蛋白V样结构域；主要表达于活化T细胞、NK细胞、巨核/血小板谱系及活化的血管内皮细胞；参与T细胞的活化与分化、血小板的活化与聚集，并参与其中的信号转导；与血小板功能异常、自身免疫性疾病、移植物抗宿主反应、病毒感染性疾病以及肿瘤等疾病的发病机制有着密切的关系。以上研究结果提示，PTA1是一个具有重要生物学功能及临床潜在应用前景的分子。 一般而言，对一个分子的全面了解应主要从三个方面入手进行研究：第一，在搞清分子结构的基础上，进一步探讨分子对机体生理功能的调节作用；第二，鉴定、克隆与其相互作用的配体；第三，观察分子所参与的信号转导过程。 既然PTA1分子具有如此重要的生理和病理作用，那么对其配体的鉴定就显得十分重要。但到目前为止，PTA1配体（PTA1 ligand，PTA1L）尚未被基因克隆，亦未见有关PTA1L的研究报道。本文的目的就是鉴定PTA1L，为最终克隆PTA1L，全面了解PTA1-PTA1L的生理、病理功能及其介导的信号转导打下基础。 为此，我们首先纯化了抗人PTA1单克隆抗体（mAb）LeoA1，并制备成亲和层析柱，以此为工具从稳定表达PTA1/Ig融合蛋白的 ！口罩区大学俗士学位论文 于文蛔婴 中国仓鼠卵母细胞系（CHO）培养上清中大量纯｛t PTAI／Ig融合 蛋白。采用间接免疫荧光染色，对多种细胞系进行流式细胞术分 析并现察 PTA的分布发现，PTA的分布及表达水平随细胞系 的不同而变化，以人内皮细胞系ECV304细胞表达水平最高，达 67．8O。通过流式细胞术观察了系歹IJ抗人 PTAllnAbS对 PTAlffg融 合蛋白与ECV304细胞结合的阻断作用，结果发现LeoAI能够完 全阻断PTAI与其配体的结合；提示 LeoAI所识别的 PTAI抗原表 位可能是其与配体结合或靠近的功能表位． 为了确定PTAIL的分子量，我们采用生物素标记技术，对高 水平表达 PTAIL的 ECV304细胞进行了生物素标j己，经 Protein －A 刀一＼IgGI预清除后，采用PTAI／Ig融合蛋白进行免疫沉淀，通过 Western．Blot检测发现，PTAIL可能为一分子量大于220kD的蛋白。 随后，观察了PTAI分子功能表位的阻断对混合淋巴细胞反应 （ML C）的调节作用．采用抗体夹。GELISA对MLC不同培养时 间上清中hl和ThZ样细胞因子的分泌水平及动态变化进行了观 察，发现 Leo川可促进几l 的产生；下调 I则1的水平，提示 LeoAI的加入可能调节T MLC中hl和ThZ样细胞困子的产生， 这与 LeoA在 MLC中抑制杀伤功能的结果相吻合。 最后，我们将纯化的 LeoA 包被于聚乙烯平 m上，筛选噬菌 体表面呈现的随机12肽库，通过三轮亲和筛选和富集，ELISA检 测证实从噬菌体随机12肽库中筛选到10个具有特异性结合活性 的重组噬菌体克隆。自动测序仪对阳性噬菌体克隆的短肽序列进 行了分析，结果显示，在具有结合 LeoA活性的阳性噬菌体克隆 短肽之间具有共同的保守基序WP Xllll。尽管此序列与＊TAI分子 胞膜外区在一级结构上无同源性，但根据亲水性及表面概率分析 显示，此序歹1基本符合形成抗原表位的条件，故推测此序列可能 与PTAI的抗原表位在空间结构或构象上相同或相似． 综上所迷，本研究的结果为进一步克隆 PTA、全面了解 PTAI．PTAIL的功能及介导的信号转导提供了重要的实验依据。