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叶绿体是植物进行光合作用的主要场所,通过光系统Ⅱ和光系统I所结合的叶绿素光和色素蛋白捕获太阳光能并转化为有机物,所以叶绿素在光和作用的捕光系统和能量转化过程中发挥着独有无可替代的的作用。水稻光和能力的强弱会直接决定水稻是否高产。若与叶绿素合成和光合作用过程相关的某一基因发生突变会影响最终的光合效率的高低。因此对叶绿素合成、叶绿体发育及光合作用相关基因的研究工作及其重要。在本研究中,调查了一个低温敏感的叶绿素缺失突变体vtm4的表型和叶绿体发育情况,同时对9311/vtm4和培矮64S(PA64S)/vtm4杂交后代F2进行了遗传分析和图位克隆,并对VTM4基因的功能从转录水平和翻译水平进行了初步分析并得到了如下结论:
(1)突变体vtm4在不同温度下的表型观察:在20℃的条件下,vtm4在4叶早期以前都表现为白化,在四叶后期新长出来的部分开始转绿;在24℃的条件下,vtm4在三叶后期转绿,四叶期完全恢复正常;而在温度高于28℃的条件下,突变体vtm4的叶色与野生型表现为一致。
(2)对vtm4的叶绿素含量测定和叶绿体超细微结构的观察及表明:在32℃时,vtm4与野生型嘉花一号的叶绿素含量几乎无差异,而在20℃时vtm4的叶绿素的各成分含量与野生型相比明显的下降趋势。与之相对应在32℃时突变体叶绿体超微结构观察表明其发育结构正常,而20℃时在突变体中观察不到完整的叶绿体结构,其整体数量极少,没有基粒垛堞形成的类囊体片层结构。
(3)对突变基因进行遗传分析和图位克隆发现:该突变体的低温敏感白化性状是由一个隐性核基因LOC-Os04g39970(VTM4)控制,并最终将突变基因定位于4号染色体上,编码一个PPR蛋白,突变位点在第一外显子上游相隔一个碱基处发生四个碱基的缺失。
(4)利用生物信息学网站预测VTM4基因编码氨基酸序列发现:此基因编码3个连续排列的PPR基序。但是通过KOME生物预测网站并未预测出其有转录的cDNA序列AK编号。组织表达分析表明该蛋白只在嫩叶中有很少的表达。生物同源性分析表明,该PPR蛋白与高粱(Sorghum)的蛋白同源关系较为相近。
(5)对VTM4基因以及与叶绿素合成、叶绿体发育相关基因在突变体及其野生型在转录水平进行检测结果表明:VTM4基因突变后会引起一些叶绿素光合蛋白基因的表达变化。VTM4基因可能直接参与调控核编码叶绿体发育相关基因LhcpⅡ的表达。
(6)根据亚细胞定位网站预测结果表明:VTM4蛋白主要定位在叶绿体内,当我们以烟草细胞作为瞬时转化对象时发现定位结果与预测的相一致。
(7)获得转基因植株T0,收获T1代种子其卡方检验分离比符合3:1,结果进一步验证了该基因的功能。
综上,本研究为该基因后期的进一步研究奠定了基础,同时也为今后深入研究PPR蛋白与叶绿体发育相关基因提供了新的理论依据。
(1)突变体vtm4在不同温度下的表型观察:在20℃的条件下,vtm4在4叶早期以前都表现为白化,在四叶后期新长出来的部分开始转绿;在24℃的条件下,vtm4在三叶后期转绿,四叶期完全恢复正常;而在温度高于28℃的条件下,突变体vtm4的叶色与野生型表现为一致。
(2)对vtm4的叶绿素含量测定和叶绿体超细微结构的观察及表明:在32℃时,vtm4与野生型嘉花一号的叶绿素含量几乎无差异,而在20℃时vtm4的叶绿素的各成分含量与野生型相比明显的下降趋势。与之相对应在32℃时突变体叶绿体超微结构观察表明其发育结构正常,而20℃时在突变体中观察不到完整的叶绿体结构,其整体数量极少,没有基粒垛堞形成的类囊体片层结构。
(3)对突变基因进行遗传分析和图位克隆发现:该突变体的低温敏感白化性状是由一个隐性核基因LOC-Os04g39970(VTM4)控制,并最终将突变基因定位于4号染色体上,编码一个PPR蛋白,突变位点在第一外显子上游相隔一个碱基处发生四个碱基的缺失。
(4)利用生物信息学网站预测VTM4基因编码氨基酸序列发现:此基因编码3个连续排列的PPR基序。但是通过KOME生物预测网站并未预测出其有转录的cDNA序列AK编号。组织表达分析表明该蛋白只在嫩叶中有很少的表达。生物同源性分析表明,该PPR蛋白与高粱(Sorghum)的蛋白同源关系较为相近。
(5)对VTM4基因以及与叶绿素合成、叶绿体发育相关基因在突变体及其野生型在转录水平进行检测结果表明:VTM4基因突变后会引起一些叶绿素光合蛋白基因的表达变化。VTM4基因可能直接参与调控核编码叶绿体发育相关基因LhcpⅡ的表达。
(6)根据亚细胞定位网站预测结果表明:VTM4蛋白主要定位在叶绿体内,当我们以烟草细胞作为瞬时转化对象时发现定位结果与预测的相一致。
(7)获得转基因植株T0,收获T1代种子其卡方检验分离比符合3:1,结果进一步验证了该基因的功能。
综上,本研究为该基因后期的进一步研究奠定了基础,同时也为今后深入研究PPR蛋白与叶绿体发育相关基因提供了新的理论依据。