【摘 要】
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嗜酸喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）是一种浸出铜矿石的典型菌株,虽然该菌株具有较高的铜抗性,但是浸出过程中积累的大量铜离子仍然会大幅度影响菌株的浸出效率。铜敏感型操纵子阻遏蛋白（CsoR）能够调控许多解毒相关的基因以抵抗极端铜胁迫压力,该蛋白的深入研究对于构建高效铜抗性菌株和提高A.caldus浸出率具有重要的理论价值和应用价值。本研究以A.caldus来源的铜敏感型
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嗜酸喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）是一种浸出铜矿石的典型菌株,虽然该菌株具有较高的铜抗性,但是浸出过程中积累的大量铜离子仍然会大幅度影响菌株的浸出效率。铜敏感型操纵子阻遏蛋白（CsoR）能够调控许多解毒相关的基因以抵抗极端铜胁迫压力,该蛋白的深入研究对于构建高效铜抗性菌株和提高A.caldus浸出率具有重要的理论价值和应用价值。本研究以A.caldus来源的铜敏感型转录因子CsoR为对象,利用分子生物学、生物化学以及EMSA等技术对CsoRAc的性质、功能以及可能的调控机制进行了一系列研究。（1）课题成功鉴定了A.caldus来源的铜敏感型转录因子CsoR。CsoRAc具有高度保守的铜离子结合关键氨基酸位点Cys33、His58和Cys62,同时具有保守的几乎全α螺旋结构以及构成“核心”区的氨基酸序列。（2）PⅢ为cso R的启动子,但PⅢ与CsoRAc的体内结合活性较弱。在E.coli DH5α中PⅢ启动子活性最高,为阴性对照的1.5倍。此外,PⅡ启动子与CsoRAc表现出了一定的体内结合活性,在受到Cu（Ⅱ）、Co（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）诱导时,菌株E.coli DH5α（p JN19-ProⅡ-EGFP）的EGFP荧光强度与自身对照组相比分别提高了约3倍、5.7倍、2.6倍以及1.8倍;但EMSA结果表明PⅡ启动子与CsoRAc无体外结合活性。（3）CsoRAc重组蛋白能够在E.coli BL21（DE3）中实现胞内可溶性表达。重组CsoRAc的分子量约为13.5 k Da,结构主要为α螺旋,在天然状态下为四聚体。每摩尔CsoRAc单体能结合0.8摩尔的Cu（Ⅰ）,CsoRAc与Cu（Ⅰ）结合后仍为四聚体状态。CsoRAc与Cu（Ⅰ）的亲和力在BCS/BCA体系中分别为2.26×10-18 mol·L-1和0.53×10-15 mol·L-1。关键氨基酸位点Cys33、His58和Cys62的定点突变基本没有改变CsoRAc的二级结构和聚体状态,也没有对蛋白的Cu（Ⅰ）结合能力产生太大影响,CsoRAc与Cu（Ⅰ）的亲和力仍与apo-CsoRAc处于同一数量级。（4）CsoRAc以四聚体的形式与靶点DNA结合,但亲和力较低,只有借助高灵敏度的荧光标记法才能观察到阻滞条带。此外,CsoRAc能够与P08430片段结合生成两种阻滞条带,条带中复合物的DNA和蛋白质比例分别为1:4和1:8。
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