[摘要]目的：通过建立稳定高表达水通道蛋白5(Aquaporin 5,AQP5)的肺癌细胞株(SPC-A1和PC-9),观察不同表达水平的AQP5对肺癌细胞增殖、侵袭迁移作用的影响,进一步探讨AQP5在肺癌发生和进展中的潜在作用。方法：构建hAQP5质粒,经过测序和基因鉴定。通过阳离子脂质体(Lipofectamine2000,L2000)介导的细胞转染,并利用G418(Geneticin)筛选后,建立稳定高表达AQP5的SPC-A1和PC-9肺癌细胞株及相对应的空载体质粒稳定转染细胞株作为对照组。应用real-time PCR和western blot方法及免疫细胞荧光法检测AQP5的表达。另外,选择显著表达AQP5的肺癌细胞株(LTEP-A2),通过siRNA基因干扰下调AQP5表达水平,应用real-time PCR和western blot方法评价siRNA对AQP5的干扰下调效果。进一步检测细胞水通透性以鉴定稳定表达的AQP5的水转运功能。通过细胞迁移、侵袭、划痕愈合实验及细胞克隆形成等体外实验,以及进行细胞生长曲线分析,观察不同AQP5表达水平对肺癌细胞体外迁移侵袭特性的影响。结果：利用G418筛选后,建立了稳定高表达AQP5的SPC-A1和PC-9肺癌细胞株及相对应的空载体稳定转染的对照细胞株,应用real-time PCR和western blot及免疫荧光法检测,表明AQP5细胞株具有稳定的AQP5高表达。体外研究发现,与对照组比较,高表达AQP5的细胞株具有显著增强的细胞迁移侵袭及细胞划痕愈合能力(p<0.01),但细胞克隆形成实验及细胞生长曲线分析未显示显著差异性(p>0.05)。而siRNA基因干扰下调AQP5表达后,肺癌细胞的迁移、侵袭及细胞划痕愈合能力显著下降(p<0.01)。体外研究还发现,高表达AQP5细胞株促进细胞的MUC5AC粘蛋白的表达。与对照组比较,高表达AQP5明显增强肺癌细胞的EGFR/ERK1/2/p38 MAPK信号通路的活性。结论：AQP5表达促进体外肺癌细胞侵袭迁移作用,EGFR/ERK/p38 MAPK信号通路可能在该机制中发挥一定的作用,但该作用效应是AQP5介导的直接作用还是间接作用有待进一步研究。[摘要]目的：利用第一部分研究已经建立稳定高表达AQP5的SPC-A1肺癌细胞株,通过建立体内肿瘤模型,探讨不同表达水平的AQP5对肺癌细胞体内侵袭迁移及增殖作用的影响。方法：选择同龄、同性及体重匹配的裸鼠,分别应用1×106 SPC-A1细胞(包括空白质粒对照组和AQP5高表达组)经尾静脉注射制作小鼠体内肺转移瘤模型,进一步根据不同时间点分组,制作小鼠体内肺转移瘤模型。分别在注射不同的时间点(0、2、4、6周)处理各组小鼠,取整体肺组织,通过在体荧光成像系统观察肺癌细胞在肺部的迁移侵袭。制作小鼠体内肺转移瘤模型后的2w、4w、6w,分别处理各组部分小鼠,收集肺组织进行石蜡包埋、切片、HE染色病理观察或冰冻切片后进行荧光显微镜观察肺癌细胞的肺部侵袭转移情况；进一步应用AQP5免疫细胞荧光染色方法观察鉴定AQP5的蛋白表达；肺组织固定、切片及HE染色后计数分析肺转移瘤情况。另一组实验：同样选择同龄、同性及体重相匹配的裸鼠,制作皮下成瘤模型：专业技术人员应用106 SPC-A1细胞(包括空白对照组和AQP5高表达组)经小鼠背部皮下注射后,应用游标卡尺,每隔3天计算检测瘤块长(L)、宽(W)径,动态监测成瘤大小(0.52xLxW2),共30天。不同时间点将相应的模型小鼠应用在体荧光成像系统观察皮下瘤块生长隋况,30天后处死小鼠,收集瘤块组织进行石蜡包埋、切片、HE染色、病理观察或冰冻切片后进行荧光显微镜观察。并应用免疫组织化学、免疫荧光技术进一步检测。此外,进一步观察不同的AQP5表达水平对MUC5AC粘蛋白及与肿瘤生长密切相关的两个重要指标PCNA、c-myc表达的影响。还有,因小鼠肺部均显著表达AQP5、AQP1及AQP3,故进一步选择野生型及相对应的种群一致的AQP5、AQP1及AQP3基因敲除小鼠,检测AQP5、AQP1及AQP3基因敲除对小鼠肺组织EGFR/ERK/p38 MAPK信号通路活性的影响。结果：制作小鼠体内肺转移瘤模型后,分别在不同的时间点(2W、4W、6W)通过在体荧光成像系统观察。与对照组比较,高表达AQP5显著促进SPC-A1细胞在小鼠体内肺转移瘤形成和肺癌细胞的侵袭和分布。病理观察还发现：AQP5高表达组的SPC-A1肺癌细胞具有显著的向外周侵袭特点：更多分布在肿瘤边缘；而对照组的SPC-A1肺癌细胞则多呈弥漫性分布。免疫细胞荧光染色进一步明确显示稳定筛选的AQP5高表达细胞在体内高表达AQP5。此外,皮下成瘤模型实验显示：皮下成瘤后2周,AQP5高表达组的瘤块体积显著大于对照组,两组间具有显著差异性(p<0.05),而4周时AQP5高表达组的瘤块体积小于对照组。结合病理观察结果：肿瘤形成晚期(4周后),AQP5高表达组的瘤块中心具有更显著的坏死区,考虑原因可能是因为其更强的增殖速度所致,中心更显著的坏死反而影响了整体瘤块的增大。免疫组织化学及免疫组织化学双标记染色显示：体内AQP5高表达促进肿瘤组织MUC5AC粘蛋白及PCNA、c-myc的表达。进一步选择野生型及AQP5、AQP1及AQP3基因敲除小鼠,检测发现AQP5基因敲除显著下调了小鼠肺组织EGFR/ERK/p38 MAPK信号通路的活性；而AQP1及AQP3基因敲除对小鼠肺组织EGFR/ERK/p38 MAPK信号通路的活性未发现有显著影响。结论：本部分体内研究进一步表明了高表达AQP5的促进肺癌细胞侵袭迁移及增殖作用,活性增强的EGFR/ERK/p38 MAPK信号通路及增强的MUC5AC粘蛋白表达可能在该机制中发挥一定的作用。[摘要]目的：利用AQP5基因敲除小鼠(AQP5-／-)及种群相匹配的野生型小鼠(AQP5+／+)作为对照组,制作铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)(P. aeruginosa, PA)感染的小鼠肺炎模型,探讨在细菌感染时,AQP5基因表达对气道及肺泡上皮屏障功能及肺部细菌的清除作用的影响。方法：选择野生型(AQP5+／+)及AQP5基因敲除(AQP5-／-)小鼠。实验组小鼠随机分为(AQP5+／+)、(AQP5-／-)组。通过气道滴入法(1×10(?)6cfu P. aeruginosa)制作急性肺部细菌感染小鼠模型。分别在感染后2小时、6小时处死小鼠,取肺泡灌洗液、血浆、并留取肺组织。血液及肺组织细菌培养检测；分类计数肺泡灌洗液(BAL)中的细胞,检测BAL的蛋白浓度、肺伊文思蓝(EBD)含量检测反映肺泡毛细血管通透性。检测湿干重比值(W／D)、髓过氧化物酶(MPO)活性；检测MCP-1、MIP-2、TNF-α等细胞趋化因子及细胞因子含量；观察肺组织病理。酶谱法检测MMP9、MMP2蛋白活性。检测AQP5基因敲除对肺组织p38MAPK/NF-κB信号通路活性的影响。体外分离培养AQP5+／+及AQP5-／-小鼠的气道上皮细胞,应用transwell细胞培养板制作气液界面模型(Air-liquid interface, ALI),进一步观察AQP5基因敲除对气液界面表面液体层厚度的影响。结果：在肺部绿脓感染小鼠模型的感染早期,AQP5基因敲除显著增加了细菌血液播散程度。降低了中性粒细胞在远端气道及肺泡腔的募集,与野生组比较,AQP5基因敲除后PA感染早期的小鼠肺髓过氧化物酶(MPO)活性显著降低,AQP5基因敲除降低了血MCP-1、MIP-2的表达水平。在PA感染后4h,与AQP5+／+小鼠组比,在AQP5-／-小鼠肺泡灌洗液(BAL)的蛋白浓度、以及用来评价肺泡毛细血管通透性的伊文思蓝(EBD)含量、湿干重比值(W／D)显著增加。在AQP5-／-组小鼠,MMP9活性在感染后4、6h表现出更为显著的激活；但在实验各组均没有观察到MMP2活性的明显变化。AQP5基因敲除减少了肺粘蛋白MUC5AC、MUC5B的mRNA表达。AQP5基因敲除还显著降低了肺组织的p38 MAPK/NF-κB信号通路活性。此外,体外研究还表明,AQP5基因敲除显著影响气液界面液体层厚度。结论：AQP5基因敲除影响肺部细菌感染的细菌清除能力,AQP5基因敲除部分影响了肺部炎症细胞的早期募集能力,加重了的肺屏障功能的损害。MAPK/NF-κB信号通路及其介导的感染早期炎症反应可能在该机制中发挥一定作用。MMP9活性,而非MMP2,在PA肺部感染早期与肺泡毛细血管通透性的改变相关。