研究背景世界卫生组织的数据显示全球每年有80万小于5岁的儿童死于腹泻疾病。在我国,2010年全国报告感染性腹泻病例74万例,而病毒性感染占实验室确诊病例的92.7%。A组轮状病毒、人星状病毒、人杯状病毒和肠道腺病毒是常见的腹泻病原体,凸隆病毒、冠状病毒、C组轮状病毒、小双节RNA病毒等也逐渐被确定为腹泻的新发病原体,其中C组轮状病毒和小双节RNA病毒在全球范围内广泛地被检出,且两者皆为节段型病毒,容易发生重配和重组,危害较大。深圳市外来人口众多,病毒发生基因交换的可能性高,且目前深圳地区尚未检出这两种病毒,研究意义重大。C组轮状病毒(Group C Rotavirus, GCRV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属,可以引起人类和动物急性胃肠炎,全基因组包括11个节段的双链RNA,编码6个病毒结构蛋白(VP1-VP4, VP6, VP7)和6个非结构蛋白(NSP1-NSP6)。 GCRV在全球范围均有检出,其宿主有人、猪、牛、狗、鸡。GCRV主要引起腹泻的散发流行,目前仅在日本、中国和英国出现过暴发疫情的报道。全球的血清学监测显示,各国的人群GCRV感染率为33%～39%,以老年人群的感染率最高。相对城市地区而言,农村的GCRV感染,年龄越小且感染率越高。除VP3基因外,人类GCRV所有RNA片段均高度保守,其中VP6基因之间的同源性最高,非结构蛋白编码基因同源性稍低。GCRV的不同种类株的混合感染多有报道,提示GCRV可能突破物种限制,能在人、猪、牛之间实现跨种传播。不同组的轮状病毒(Rotavirus, RV)的共同感染不仅可能造成RV组间的基因转移,且会加大对肠道的伤害。与GARV引起的重症腹泻相比,GCRV引起的症状比较缓和,但人GCRV可能造成婴幼儿等不同人群的肝外胆道闭锁,而牛GCRV可能造成奶牛的减产,对人类的健康和经济都有不利的影响。小双节RNA病毒(Picobirnavirus, PBV)是一组小的、非包膜的双节段的双链RNA病毒,大的节段基因编码衣壳蛋白、而小的节段基因编码依赖RNA的RNA聚合酶。PBV的宿主为包括人类在内的各种不同的脊椎动物。自从在1988年的一起儿童急性胃肠炎暴发中的腹泻样品中偶然检出以来,PBV在腹泻疾病的作用引起了研究者的关注。在非腹泻的健康宿主中,PBV也可被频繁检出,有研究推测PBV可能是免疫不全个体的机会致病菌。PBV的早期检测主要是PAGE-SS法,分为大基因组型和小基因组型。以两个原型株(1型的GGI/PBV/h uman/China/1-CHN-97/1997和2型的GGII/PBV/human/USA/4-GA-91/1991)在编码RdRp区域的保守片段设计引物对,有效性在世界多个研究中得到验证。PBV在多个国家的人类粪便样品中检出,从低至0.09%到13%不等。目前从粪便和环境中检出的大部分PBV属于GI型,且GenBank上的PBV序列,至少有95%是关于GI型PBV,提示GI型PBV一直是优势株,但也可能是GⅡ型的引物对的检测能力不足。目前采用的系统发育研究没有显示任何基于地理分布上的聚类,提示PBV的普遍存在和同时传播。猪PBV都属于GI型,提示PBV可能作为准种存在,在系统发育分析显示,猪PBV与人PBV相关,人PBV也与猪PBV有关系,跨种属传播的可能很大。早期研究显示,没有发现核苷酸序列相同的PBV株,来自相同地理位置上的分离株,比起来自一些急性胃肠炎爆发的分离株,它们之间的关系更为紧密。后来,在加尔各答的腹泻小马的身上检出马PBV,它却与相同地域的人PBV共有完全一致的序列,且与匈牙利报道的猪PBV的同源性紧密相关。研究方法收集2011年和2012年深圳腹泻哨点监测系统的腹泻疑似样品,经过样品的预处理、RNA的提取后,分别采用荧光实时PCR和RT-PCR筛查C组轮状病毒和小双节RNA病毒,分离得到的C组轮状病毒阳性株,通过17对特异引物对扩增C组轮状病毒的全基因组序列；小双节RNA阳性株仅扩增GI型特异片段。对扩增的GCRV特异片段双向测序,拼接序列。从GenBank数据库中分别下载包含完整编码序列的11节段的GCRV同源序列和GI型PBV的同源序列,并采集关于序列的信息。寻找最优的核苷酸替代模型,采用最大似然法,重构基因的最大似然树。通过BLAST检索,了解与检出的GI型PBV分离株最为相关的序列信息。构建核苷酸相似性和氨基酸相似性矩阵,了解阳性株之间的相似性,构建系统发育树,探究深圳地区GI型PBV的聚类情况。研究结果1.在2011年收集的1158份腹泻疑似样品中,筛查到2株GCRV分离株,命名为94-SZ11株和272-SZ11株。2名GCRV阳性的腹泻患者都是成人,GCRV在各个年龄组、性别、季节、医院的检出率都没有统计学差异,腹泻症状缓和。2.成功扩增出GCRV的11个节段,经测序、拼接得到2个GCRV分离株的全基因组序列。11个节段基因在核苷酸和氨基酸的同源性分别为>196.1%和≥97.0%,基因非常保守,同源性高。重构基于最优核苷酸替代模型的11个节段的最大似然树,对两个GCRV阳性株的11个节段进行分型,结果显示深圳地区的GCRV分离株都是G4-P[2]-I2-R2-C2-M3-A2-N2-T2-E2-H2型。3.在2012年收集的1143份腹泻疑似样品中,筛查到8株GI型PBV,命名为78-SZ12、184-SZ12、187-SZ12、275-SZ12、406-SZ12、740-SZ12、827-SZ12、1077-SZ12分离株。8个GI型PBV阳性的腹泻患者均为成人,男女比为5：3,分别来自北大深圳医院和龙岗人民医院,检出率在年龄、性别、医院之间有统计学差异,在季节分布上没有统计学差异。8个GI型PBV阳性患者,其中5例伴有诺如病毒GII型的混合感染。4.8个GI型PBV分离株的基因相似性低,核苷酸和氨基酸相似性平均值分别为70%和74%。与其最相近的GI型PBV参考株当中,4株曾从美国的污水中检出,4株曾从美国、印度、匈牙利的人体检出,核苷酸同源性显示为79%-100%。重构系统发育树结果表明深圳地区8株GI型PBV形成两个进化支,其中一支与荷兰和匈牙利的参考株相近,另一支与印度和美国的参考株相近。研究结论1.深圳地区的GCRV检出率低至0.16%,没有年龄组、性别、季节和医院分布差异。两个GCRV分离株94-SZ11和272-SZ11都属于M3群,与东亚株群最为紧密,与南亚株群关系较远。2.人源GCRV在全球的起源时间和地点很可能是1973年的澳大利亚墨尔本。韩国的CAU10-312株可能是Bristol株与V508株的重组株传播到了韩国。3.深圳地区的GI型PBV仅在成人中检出,没有明显的季节特征,大部分伴有混合感染。8株GI型PBV分成两个进化支,同一进化支的分离株相似性高,不同进化支之间相似性低。