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研究背景和目的血管内皮细胞（Vascular endothelial cell,VEC）在维持血管屏障、控制血管通透性和调节血管张力等方面发挥重要作用,VEC损伤会引发多种疾病。促进VEC再生、维持VEC正常功能和损伤修复成为目前再生医学研究的重点。然而成体干细胞和内皮祖细胞的来源相对较少限制了该方法的临床应用。人真皮成纤维细胞（Human dermal fibroblasts,HDFs）在人体内含量丰富。研究表明HDFs具有多向分化潜能。因此,诱导HDFs向VEC分化,进而治疗相关疾病成为本论文研究的目标。早前研究者利用重编程和直接重编程技术诱导其他成体细胞分化形成VEC的研究得到了极大应用。然而,研究者发现重编程技术具有严重的细胞致死性和致瘤性。化学小分子具有性价比高、效应快的优势,成为诱导HDFs分化形成VEC的另一种研究方法。因此,找到能够高效诱导HDFs分化形成VEC的化学小分子成为当前亟待解决的问题。目前,HDFs向VEC分化的机制尚不明确。研究表明次氯酸（Hypochlorous acid,HOCl）能够通过氧化修饰生物大分子调控细胞信号通路,从而在细胞生长、增殖和凋亡等生命过程中发挥作用。然而,HOCl在调控HDFs向VEC分化过程中的作用尚未研究清楚。之前研究已证明HOCl探针ZBM-H能够结合HOCl调控细胞自噬。因此,本论文以HOCl探针CPP（（E）-4-（4-（4-（7-（二乙基氨基）-2-氧代-2H-色烯-3-羰基）哌嗪-1-基）苯乙烯基）-1-甲基吡啶-1-碘盐）为工具,研究HDFs向VEC分化的机制。本论文研究证明了 HOCl探针CPP能够诱导HDFs分化成具有一定功能的VEC。我们进一步以CPP为工具研究HDFs向VEC分化的机制发现,CPP通过结合HOCl干扰其对脯氨酰-4-羟化酶2（prolyl 4-hydroxylase,PHD2）的Cys302位点的氧化修饰,抑制PHD2酶活性,升高缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）蛋白水平,进而提高HIF-1α下游靶基因和内皮关键性转录因子Hairy相关转录因子1（Hairy-related transcription factor 1,HEY 1）的表达,促进 HDFs 分化形成 VEC。最后我们发现CPP诱导HDFs分化形成的VEC能够治疗BALB/C裸鼠的下肢缺血。综上,本论文研究不仅证明了 HOCl探针CPP能够诱导HDFs向VEC分化,而且我们以CPP为工具,研究了 HDFs向VEC分化的机制和分化形成的VEC在下肢缺血中的应用。本研究从化学生物学角度出发,利用有活性的化学小分子,发现了调控HDFs向VEC分化的新信号通路,为开发修复血管功能的新技术和新药先导化合物提供了实验证据,为将来开发治疗各种缺血性疾病的新策略奠定了基础。研究内容1.HOCl探针CPP诱导HDFs向VEC分化。1.1 CPP诱导HDFs分化形成VEC的鉴定。1.2 CPP诱导HDFs分化形成的VEC的功能研究。2.HOCl探针CPP诱导HDFs分化形成VEC的机制研究。2.1研究HIF-1α在HDFs分化形成VEC中的作用。2.2研究PHD2在HDFs分化形成VEC中的作用。2.3研究HEY1在HDFs分化形成VEC中的作用。3.HOCl探针CPP诱导HDFs分化形成的VEC在治疗BALB/C裸鼠下肢缺血中的应用。3.1 BALB/C裸鼠的下肢缺血模型的建立。3.2研究CPP诱导的HDFs对BALB/C裸鼠缺血部位的治疗作用。研究方法1.RT-qPCR检测相关基因表达。2.流式细胞术检测CPP诱导HDFs向VEC分化的效率。3.Dil-ac-LDL吞噬实验检测CPP诱导HDFs分化形成的VEC的功能。4.鸡胚尿囊膜实验检测CPP诱导产生的VEC参与血管生成的能力。5.Western blot检测相关蛋白的水平。6.PHD2酶活检测试剂盒检测PHD2酶活性。7.PHD2突变体质粒转染实验明确CPP对其作用位点。8.RNA-seq实验寻找CPP提高HIF-1α蛋白水平后,诱导HDFs向VEC分化的切入点。9.抑制剂处理或RNA干扰实验检测特定蛋白的作用。10.小鼠体内注射CPP后检测表达HEY1、CD31、CDH5的Vimentin阳性细胞数的变化。11.激光多普勒、H＆E染色、FITC-BSL1染色检测CPP诱导HDFs产生的VEC对BALB/C裸鼠下肢缺血模型的治疗作用。研究结果1.CPP诱导HDFs分化形成VEC的鉴定。1.1 CPP促进CD31、CD133的表达,抑制Vimentin的表达。1.2 CPP以浓度和时间依赖的方式促进ERG、vWF、KDR、CDH5、TEK的表达。1.3 CPP上调HDFs中KDR和CDH5的蛋白水平。2.CPP诱导HDFs分化形成的VEC的功能研究。2.1CPP促进促血管生成因子VEGF、FGF-2、PDGF-BB的表达。2.2 CPP诱导HDFs产生的VEC吞噬Dil-ac-LDL的能力增强。2.3 CPP诱导HDFs产生的VEC参与CAM血管生成。3.研究HIF-1α在HDFs分化形成VEC中的作用。3.1 CPP通过调控HIF-1α蛋白降解途径促进HIF-1α蛋白水平升高。3.2 HIF-1α抑制剂LW6处理细胞后,CPP不能诱导HDFs向VEC分化。3.3 CPP不直接靶向HIF-1α,而是通过靶向PHD2调控HIF-1α蛋白水平。4.研究PHD2在HDFs分化形成VEC中的作用。4.1 CPP抑制PHD2的酶活性。4.2外源HOCl显著抑制CPP的作用,使CPP不能抑制PHD2酶活性和上调HIF-1α蛋白水平。4.3 CPP通过干预PHD2 Cys302位点的氧化修饰,抑制PHD2酶活性,上调HIF-1α蛋白水平,诱导HDFs分化形成VEC。5.研究HEY1在HDFs分化形成VEC中的作用。5.1 RNA-seq结果显示CPP处理HDFs后,HEY1的表达量上调。5.2 Western blot和RT-qPCR实验证明CPP促进HEY1的表达。5.3干扰HEY1后,CPP不能诱导HDFs分化形成VEC。6.成功构建BALB/C裸鼠下肢缺血模型。7.研究CPP诱导的HDFs对BALB/C裸鼠下肢缺血部位的治疗作用。7.1 CPP处理的HDFs促进缺血部位的血流灌注量。7.2 CPP处理的HDFs促进缺血部位后肢形态恢复。7.3 CPP处理的HDFs降低缺血部位腓肠肌的纤维化。7.4 CPP处理的HDFs增加缺血部位的血管密度。结论1.CPP诱导HDFs分化形成具有正常功能的VEC。2.CPP通过上调HIF-1α蛋白水平,诱导HDFs向VEC分化。3.CPP通过抑制HOCl对PHD2的Cys302位点氧化修饰,抑制PHD2酶活性。4.CPP通过促进HEY1表达诱导HDFs向VEC分化。5.CPP诱导HDFs分化形成的VEC促进BALB/C裸鼠缺血后肢的恢复。