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糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要微血管病变之一，也是导致终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)的主要原因。统计显示近年来DN的患病人数不断增加，给社会和个人带来沉重的经济负担。糖尿病肾病的发病机制复杂，目前临床上的治疗方案，并不能有效干预DN的进程，减少其引起的ESRD。研究表明遗传因素、血流动力学改变、糖脂代谢紊乱、氧化应激、炎性反应以及自噬等均参与了DN的病理生理过程，而足细胞损伤是DN的早期事件，也是引起蛋白尿、细胞外基质积聚和肾小球硬化的主要原因。因此研究足细胞损伤机制以期寻找参与足细胞损伤的关键分子，用于DN的防治具有重要理论意义和实际应用价值。
iRhom2(inactiverhomboidprotein2，iRhom2，由Rhbdf2基因编码)蛋白是Rhomboid家族中位于膜内的一种不活跃的丝氨酸蛋白酶，参与细胞内分子从内质网到高尔基体的转运，2012年《Science》和2016年《NatureImmunology》相继报道iRhom2参与ADAM17(也称为TACE，Tumornecrosisfactor-αconvertingenzyme，肿瘤坏死因子-α转化酶)和STING从内质网到高尔基的转运，在炎症相关疾病和DNA病毒介导的固有免疫中发挥重要作用。目前有关iRhom2生物学功能的研究主要集中在肿瘤、类风湿关节炎及代谢性疾病等方面，iRhom2在糖尿病肾病特别是足细胞损伤中的作用尚不明确。因此本课题主要探究iRhom2在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用并对其机制进行初步探讨。
研究目的:
1.通过体内动物实验和体外细胞实验明确iRhom2在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用，为糖尿病肾病的防治提供新的靶点。
2.初步探究iRhom2参与糖尿病肾病足细胞损伤的机制。
研究方法:
第一部分:iRhom2在糖尿病肾病动物模型中的表达变化
1.1iRhom2在C57BL/6J野生型小鼠(Wild type，WT)中各组织器官及肾脏实质细胞系中的表达
用蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)分别检测iRhom1，iRhom2在WT小鼠的心，肝，脾，肺，肾，脑，小肠及胃中的蛋白表达水平;并检测肾脏各实质细胞系中iRhom1，iRhom2的表达水平，即大鼠肾小球系膜细胞(RMC)，大鼠肾小球内皮细胞(GENC)，小鼠足细胞(MPC)，及大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)，小鼠巨噬细胞(RAW)作为阳性对照。
1.2检测iRhom2在2型糖尿病模型及高脂诱导的肾脏损伤模型中的表达变化
1.2.1自发性2型糖尿病db/db小鼠模型:购入一批db/m和db/db小鼠，将db/m小鼠作为对照。在小鼠饲养至20周时，取小鼠肾脏标本，应用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测Rhbdf1及Rhbdf2mRNA的表达，WB及免疫组化染色(Immunohistochemical-staining，IHC)检测iRhom2蛋白的表达。
1.2.2高脂饮食建立高脂诱导的肾脏损伤模型:选取8周C57BL/6J雄性小鼠，摘除单肾，喂养两周正常饲料，改用60％的高脂(High fat diet，HFD)饲料继续喂养6个月，取小鼠肾脏标本，应用RT-qPCR检测Rhbdf1及Rhbdf2mRNA的表达，WB及免疫组化染色检测iRhom2蛋白的表达。
1.3体外细胞实验模拟糖尿病肾病条件刺激MPC,检测iRhom2的表达变化。
MPC细胞12h无血清饥饿处理后，换成正常培养基，加入高糖(High glucose，HG)使细胞生长环境中葡萄糖浓度分别为15mM，30mM，以30mM浓度的甘露醇作为渗透压对照，HG刺激24h，WB检测iRhom2蛋白水平的表达变化;另外MPC细胞12h无血清饥饿处理后，分别用糖基化终末产物(Advancedglycationendproducts，AGEs浓度梯度为:0、50、100、200μg/ml)、棕榈酸(Palmiticacid,PA，浓度梯度为0、125、250、500μmol/L)、胆固醇(Cholesterol，浓度梯度为:0、100、200、400μg/mL)、氧化低密度脂蛋白(Oxidationlowlipoprotein，oxLDL，浓度梯度为:0、20、40、80μg/mL)刺激24h，WB检测在体外模拟不同的糖尿病肾病刺激条件下，MPC中iRhom2的表达变化。
1.4.高糖刺激肾脏实质细胞检测iRhom2表达变化
体外培养肾小球内皮细胞(GENC)、系膜细胞(RMC)和肾小管上皮细胞(NRK-52E)，12h无血清饥饿处理后，分别用15mM，30mM高糖进行刺激，30mM甘露醇作为渗透压对照组，刺激24h后WB检测肾脏实质细胞中iRhom2的表达变化。
第二部分:iRhom2在糖尿病肾病中的作用及机制的初步探讨
2.1动物实验验证iRhom2在2型糖尿病肾病及高脂诱导的肾脏损伤中的作用
2.1.1验证iRhom2在自发性2型糖尿病db/db小鼠中的作用
将Rhbdf2-/-小鼠和db/m小鼠进行交配，鉴定出db/m//Rhbdf-/-基因型小鼠，再次与Rhbdf2-/-小鼠交配，得到db/m//Rhbdf+/-基因型小鼠，继续繁殖可获得Rhbdf2-/-//db/db小鼠，用同笼Rhbdf2+/+//db/db作为对照小鼠。
分别于8周，12周，16周，20周等时间点测量其尿微量白蛋白水平，在20周取小鼠血清及肾脏标本。利用PAS染色观察Rhbdf2敲除的db/db小鼠肾小球形态学变化，免疫荧光检测小鼠足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达，并进一步观察足细胞内尿激酶型纤溶酶原激活物受体(Urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)以及足细胞骨架蛋白Desmin表达水平的变化，明确iRhom2在2型糖尿病db/db小鼠模型中的作用。
2.1.2足细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠的构建
利用Cre-loxp系统构建podocin-cre+/-/Rhbdf2fl/fl小鼠，将Rhbdf2-loxp雄鼠(Rhbdf2fl/fl，购于上海南方模式中心)与足细胞podocin-cre雌鼠(购买于Jackson实验室)交配，得到第一代子代F1，鉴定出基因型为podocin-cre+/-/Rhbdf2fl/+的小鼠，继续繁殖得到podocin-cre+/-/Rhbdf2fl/fl小鼠为足细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠标记为pod-cre+/-/Rhbdf2fl/fl，用同窝的podocin-cre-/-/Rhbdf2fl/fl作为对照组小鼠标记为pod-cre-/-/Rhbdf2fl/fl。
琼脂糖凝胶电泳实验鉴定pod-cre+/-/Rhbdf2fl/fl鼠的基因型，同时iRhom2与足细胞标记蛋白WT1和Synaptopodin免疫荧光双标，检测pod-cre+/-/Rhbdf2fl/fl鼠Rhbdf2在足细胞特异性敲除效率。
2.1.3验证iRhom2在高脂诱导的肾脏损伤中的作用
8周pod-cre-/-/Rhbdf2fl/fl和pod-cre+/-/Rhbdf2fl/fl小鼠摘除单肾，正常喂养两周后，分别分为Control组和HFD组，Control组喂养普通饲料，HFD组改用60％的高脂饲料进行喂养，6个月后取小鼠血清和肾脏标本。用小鼠肾脏石蜡切片进行PAS染色观察肾小球糖原蓄积，Nephrin、Podocin、uPAR以及Desmin的免疫荧光染色检测肾小球损伤，验证iRhom2在高脂诱导的肾脏损伤中的作用。
2.2体外检测iRhom2在糖尿病肾病中的作用
小鼠足细胞(MPC)转染siRNA-Rhbdf2沉默Rhbdf2，Scramble作为对照，利用WB的方法检测沉默效率。基因沉默Rhbdf2后，高糖HG(30 mM)刺激足细胞，利用WB检测Nephrin、uPAR的蛋白表达水平，验证基因沉默Rhbdf2对HG条件下足细胞功能的影响。
2.3iRhom2在糖尿病肾病中的作用机制初步探索
2.3.1Rhbdf2敲除对糖尿病肾病小鼠肾小球及足细胞中脂质蓄积的作用
20周Rhbdf2-/-db/db小鼠肾脏切片进行油红O染色观察肾小球中的脂质蓄积情况，同时脂滴相关蛋白Adipophilin与足细胞标记蛋白Synaptopodin荧光双标，应用激光共聚焦观察足细胞中脂质蓄积。同时对pod-cre+/-/Rhbdf2fl/flHFD小鼠肾脏切片进行油红O染色和脂滴相关蛋白Adipophilin与足细胞标记蛋白Synaptopodin荧光双标，观察在HFD诱导的肾脏损伤中，足细胞特异性敲除Rhbdf2，对肾小球及足细胞中脂质蓄积影响。
2.3.2体外基因沉默MPC细胞中Rhbdf2的表达，观察iRhom2对高糖刺激引起的足细胞脂质蓄积的影响
30mM的高糖刺激MPC细胞24h后，进行油红O染色实验，检测基因沉默Rhbdf2对高糖引起的足细胞脂质蓄积的影响。
2.3.3iRhom2减轻高糖引起的脂质蓄积的初步机制探讨
基因沉默Rhbdf2，30mM的高糖刺激MPC细胞24h后，利用WB实验检测MPC细胞中SREBP2蛋白的剪切水平，初步探讨iRhom2是否通过促进SREBP2的剪切，调控高糖引起的脂质蓄积。
研究结果
第一部分:iRhom2在糖尿病肾病及高脂诱导的肾脏损伤模型肾皮质中的表达显著升高
1.1iRhom2在WT小鼠的各个器官组织和肾脏不同细胞系中的表达分布
WB实验结果显示iRhom1，iRhom2在WT小鼠的心，肝，脾，肺，肾，脑，小肠及胃中均有表达，iRhom2在肾脏中有相对较高表达，提示其可能在肾脏功能调控中可能发挥重要作用。同时检测iRhom1，iRhom2在肾脏各实质细胞中的表达，WB结果显示与小鼠巨噬细胞系RAW相比，iRhom2在MPC细胞中有相对较高表达。
1.2iRhom2在2型糖尿病模型及高脂诱导的肾脏损伤模型中的表达显著升高
RT-qPCR结果显示自发性2型糖尿病db/db小鼠肾皮质中，Rhbdf2mRNA的表达与db/m组相比显著升高，而Rhbdf1的表达无明显变化;WB的结果进一步表明iRhom2表达显著升高，免疫组化结果也验证了自发性2型糖尿病db/db小鼠iRhom2的表达显著升高，并且主要表达在肾小球中。HFD诱导的肾脏损伤模型对小鼠肾脏皮质进行RT-qPCR检测，结果显示与对照相比，HFD诱导的肾脏损伤模型小鼠肾皮质中的Rhbdf2mRNA表达显著升高，而Rhbdf1mRNA的无明显变化;WB及免疫组化结果进一步验证iRhom2蛋白水平显著升高，且iRhom2的表达升高主要在肾小球。
1.3iRhom2在体外模拟糖尿病肾病条件刺激的足细胞中表达显著升高
WB实验结果显示iRhom2在15mM，30mM浓度的HG刺激下蛋白表达水平均明显升高，其中在30mM条件下升高更显著，后期体外HG刺激选用此浓度。WB结果进一步显示，其他模拟体内糖尿病诱发因素如AGEs、PA、胆固醇、oxLDL均可诱导足细胞内iRhom2的蛋白表达升高，并呈剂量依赖性。
1.4.高糖刺激肾脏实质细胞iRhom2表达变化
WB结果显示，在高糖刺激条件下肾小球内皮细胞(GENC)中iRhom2相比于甘露醇对照组蛋白表达水平有升高趋势，但无统计学意义，而系膜细胞(RMC)和肾小管上皮细胞(NRK-52E)中iRhom2蛋白水平均无明显变化。
第二部分:iRhom2在糖尿病肾病中的作用及机制研究
1.iRhom2在2型糖尿病肾病及高脂诱导的肾脏损伤模型中的作用
1.1体内动物实验中敲除Rhbdf2对2型糖尿病肾病及高脂诱导的肾脏损伤模型的影响
1.1.1Rhbdf2敲除可以减轻db/db小鼠肾小球足细胞损伤。尿微量白蛋白检测统计结果显示Rhbdf2敲除可以明显减轻db/db小鼠的尿微量白蛋白水平。PAS染色结果显示Rhbdf2敲除可以显著减轻db/db小鼠肾小球系膜基质增生、基底膜增厚。Nephrin、Podocin、Desmin及uPAR免疫荧光染色结果显示Rhbdf2敲除可显著的减轻db/db小鼠的足细胞损伤。
1.1.2足细胞特异性Rhbdf2敲除可以减轻HFD诱导的肾脏损伤小鼠中足细胞的损伤。对podo-cre+/-/Rhbdf2fl/fl鼠肾脏的石蜡切片进行PAS染色，结果显示足细胞特异性Rhbdf2敲除可以显著的改善HFD诱导的肾小球系膜基质增生、基底膜增厚形态学改变，Nephrin、Podocin、Desmin及uPAR的免疫荧光染色实验进一步证明足细胞特异性敲除Rhbdf2可显著减轻HFD引起的足细胞损伤。
1.2基因沉默Rhbdf2可以减轻HG引起的足细胞损伤
WB结果显示siRNA-Rhbdf2转染可显著抑制MPC中iRhom2蛋白表达，部分恢复HG刺激引起的Nephrin表达水平下降及uPAR表达水平的升高，对足细胞起到保护作用。
2.iRhom2可能通过调控足细胞中脂质沉积促进足细胞损伤
2.1Rhbdf2缺失减少db/db鼠及高脂喂养小鼠肾小球中脂质沉积
油红O结果显示，全身敲除Rhbdf2或足细胞特异性敲除Rhbdf2可显著减少db/db鼠及高脂喂养小鼠肾小球中的脂质沉积。Adipophilin和Synaptopodin荧光双标实验进一步表明Rhbdf2的缺失可减少足细胞中脂质沉积。
2.2沉默Rhbdf2减少MPC细胞中脂质沉积
油红O实验结果显示沉默Rhbdf2可显著降低高糖刺激引起的足细胞脂质蓄积。WB结果显示沉默Rhbdf2可部分逆转高糖刺激引起的SREBP2剪切水平升高，提示iRhom2可能通过促进SREBP2的剪切引起足细胞脂质蓄积。
结论与创新性:
1.2型糖尿病肾病db/db小鼠及高脂诱导的肾脏损伤模型中，iRhom2在肾皮质中的表达显著升高，基因敲除Rhbdf2减轻db/db小鼠足细胞损伤，进一步通过构建足细胞特异性敲除小鼠podo-cre+/-/Rhbdf2fl/fl并构建高脂诱导的肾脏损伤小鼠模型，发现足细胞特异性敲除Rhbdf2显著减高脂引起的足细胞损伤。iRhom2可能通过促进SREBP2的剪切引起足细胞脂质蓄积，导致足细胞损伤。
2.本实验通过动物实验及体外细胞实验首次探讨了iRhom2促进2型糖尿病肾病及高脂诱导足细胞损伤，并发现其可能通过调控足细胞中脂质沉积促进足细胞损伤，为糖尿病肾病的防治提供潜在的新靶点，具有重要理论意义和潜在的应用价值。
iRhom2(inactiverhomboidprotein2，iRhom2，由Rhbdf2基因编码)蛋白是Rhomboid家族中位于膜内的一种不活跃的丝氨酸蛋白酶，参与细胞内分子从内质网到高尔基体的转运，2012年《Science》和2016年《NatureImmunology》相继报道iRhom2参与ADAM17(也称为TACE，Tumornecrosisfactor-αconvertingenzyme，肿瘤坏死因子-α转化酶)和STING从内质网到高尔基的转运，在炎症相关疾病和DNA病毒介导的固有免疫中发挥重要作用。目前有关iRhom2生物学功能的研究主要集中在肿瘤、类风湿关节炎及代谢性疾病等方面，iRhom2在糖尿病肾病特别是足细胞损伤中的作用尚不明确。因此本课题主要探究iRhom2在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用并对其机制进行初步探讨。
研究目的:
1.通过体内动物实验和体外细胞实验明确iRhom2在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用，为糖尿病肾病的防治提供新的靶点。
2.初步探究iRhom2参与糖尿病肾病足细胞损伤的机制。
研究方法:
第一部分:iRhom2在糖尿病肾病动物模型中的表达变化
1.1iRhom2在C57BL/6J野生型小鼠(Wild type，WT)中各组织器官及肾脏实质细胞系中的表达
用蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)分别检测iRhom1，iRhom2在WT小鼠的心，肝，脾，肺，肾，脑，小肠及胃中的蛋白表达水平;并检测肾脏各实质细胞系中iRhom1，iRhom2的表达水平，即大鼠肾小球系膜细胞(RMC)，大鼠肾小球内皮细胞(GENC)，小鼠足细胞(MPC)，及大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)，小鼠巨噬细胞(RAW)作为阳性对照。
1.2检测iRhom2在2型糖尿病模型及高脂诱导的肾脏损伤模型中的表达变化
1.2.1自发性2型糖尿病db/db小鼠模型:购入一批db/m和db/db小鼠，将db/m小鼠作为对照。在小鼠饲养至20周时，取小鼠肾脏标本，应用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测Rhbdf1及Rhbdf2mRNA的表达，WB及免疫组化染色(Immunohistochemical-staining，IHC)检测iRhom2蛋白的表达。
1.2.2高脂饮食建立高脂诱导的肾脏损伤模型:选取8周C57BL/6J雄性小鼠，摘除单肾，喂养两周正常饲料，改用60％的高脂(High fat diet，HFD)饲料继续喂养6个月，取小鼠肾脏标本，应用RT-qPCR检测Rhbdf1及Rhbdf2mRNA的表达，WB及免疫组化染色检测iRhom2蛋白的表达。
1.3体外细胞实验模拟糖尿病肾病条件刺激MPC,检测iRhom2的表达变化。
MPC细胞12h无血清饥饿处理后，换成正常培养基，加入高糖(High glucose，HG)使细胞生长环境中葡萄糖浓度分别为15mM，30mM，以30mM浓度的甘露醇作为渗透压对照，HG刺激24h，WB检测iRhom2蛋白水平的表达变化;另外MPC细胞12h无血清饥饿处理后，分别用糖基化终末产物(Advancedglycationendproducts，AGEs浓度梯度为:0、50、100、200μg/ml)、棕榈酸(Palmiticacid,PA，浓度梯度为0、125、250、500μmol/L)、胆固醇(Cholesterol，浓度梯度为:0、100、200、400μg/mL)、氧化低密度脂蛋白(Oxidationlowlipoprotein，oxLDL，浓度梯度为:0、20、40、80μg/mL)刺激24h，WB检测在体外模拟不同的糖尿病肾病刺激条件下，MPC中iRhom2的表达变化。
1.4.高糖刺激肾脏实质细胞检测iRhom2表达变化
体外培养肾小球内皮细胞(GENC)、系膜细胞(RMC)和肾小管上皮细胞(NRK-52E)，12h无血清饥饿处理后，分别用15mM，30mM高糖进行刺激，30mM甘露醇作为渗透压对照组，刺激24h后WB检测肾脏实质细胞中iRhom2的表达变化。
第二部分:iRhom2在糖尿病肾病中的作用及机制的初步探讨
2.1动物实验验证iRhom2在2型糖尿病肾病及高脂诱导的肾脏损伤中的作用
2.1.1验证iRhom2在自发性2型糖尿病db/db小鼠中的作用
将Rhbdf2-/-小鼠和db/m小鼠进行交配，鉴定出db/m//Rhbdf-/-基因型小鼠，再次与Rhbdf2-/-小鼠交配，得到db/m//Rhbdf+/-基因型小鼠，继续繁殖可获得Rhbdf2-/-//db/db小鼠，用同笼Rhbdf2+/+//db/db作为对照小鼠。
分别于8周，12周，16周，20周等时间点测量其尿微量白蛋白水平，在20周取小鼠血清及肾脏标本。利用PAS染色观察Rhbdf2敲除的db/db小鼠肾小球形态学变化，免疫荧光检测小鼠足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达，并进一步观察足细胞内尿激酶型纤溶酶原激活物受体(Urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)以及足细胞骨架蛋白Desmin表达水平的变化，明确iRhom2在2型糖尿病db/db小鼠模型中的作用。
2.1.2足细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠的构建
利用Cre-loxp系统构建podocin-cre+/-/Rhbdf2fl/fl小鼠，将Rhbdf2-loxp雄鼠(Rhbdf2fl/fl，购于上海南方模式中心)与足细胞podocin-cre雌鼠(购买于Jackson实验室)交配，得到第一代子代F1，鉴定出基因型为podocin-cre+/-/Rhbdf2fl/+的小鼠，继续繁殖得到podocin-cre+/-/Rhbdf2fl/fl小鼠为足细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠标记为pod-cre+/-/Rhbdf2fl/fl，用同窝的podocin-cre-/-/Rhbdf2fl/fl作为对照组小鼠标记为pod-cre-/-/Rhbdf2fl/fl。
琼脂糖凝胶电泳实验鉴定pod-cre+/-/Rhbdf2fl/fl鼠的基因型，同时iRhom2与足细胞标记蛋白WT1和Synaptopodin免疫荧光双标，检测pod-cre+/-/Rhbdf2fl/fl鼠Rhbdf2在足细胞特异性敲除效率。
2.1.3验证iRhom2在高脂诱导的肾脏损伤中的作用
8周pod-cre-/-/Rhbdf2fl/fl和pod-cre+/-/Rhbdf2fl/fl小鼠摘除单肾，正常喂养两周后，分别分为Control组和HFD组，Control组喂养普通饲料，HFD组改用60％的高脂饲料进行喂养，6个月后取小鼠血清和肾脏标本。用小鼠肾脏石蜡切片进行PAS染色观察肾小球糖原蓄积，Nephrin、Podocin、uPAR以及Desmin的免疫荧光染色检测肾小球损伤，验证iRhom2在高脂诱导的肾脏损伤中的作用。
2.2体外检测iRhom2在糖尿病肾病中的作用
小鼠足细胞(MPC)转染siRNA-Rhbdf2沉默Rhbdf2，Scramble作为对照，利用WB的方法检测沉默效率。基因沉默Rhbdf2后，高糖HG(30 mM)刺激足细胞，利用WB检测Nephrin、uPAR的蛋白表达水平，验证基因沉默Rhbdf2对HG条件下足细胞功能的影响。
2.3iRhom2在糖尿病肾病中的作用机制初步探索
2.3.1Rhbdf2敲除对糖尿病肾病小鼠肾小球及足细胞中脂质蓄积的作用
20周Rhbdf2-/-db/db小鼠肾脏切片进行油红O染色观察肾小球中的脂质蓄积情况，同时脂滴相关蛋白Adipophilin与足细胞标记蛋白Synaptopodin荧光双标，应用激光共聚焦观察足细胞中脂质蓄积。同时对pod-cre+/-/Rhbdf2fl/flHFD小鼠肾脏切片进行油红O染色和脂滴相关蛋白Adipophilin与足细胞标记蛋白Synaptopodin荧光双标，观察在HFD诱导的肾脏损伤中，足细胞特异性敲除Rhbdf2，对肾小球及足细胞中脂质蓄积影响。
2.3.2体外基因沉默MPC细胞中Rhbdf2的表达，观察iRhom2对高糖刺激引起的足细胞脂质蓄积的影响
30mM的高糖刺激MPC细胞24h后，进行油红O染色实验，检测基因沉默Rhbdf2对高糖引起的足细胞脂质蓄积的影响。
2.3.3iRhom2减轻高糖引起的脂质蓄积的初步机制探讨
基因沉默Rhbdf2，30mM的高糖刺激MPC细胞24h后，利用WB实验检测MPC细胞中SREBP2蛋白的剪切水平，初步探讨iRhom2是否通过促进SREBP2的剪切，调控高糖引起的脂质蓄积。
研究结果
第一部分:iRhom2在糖尿病肾病及高脂诱导的肾脏损伤模型肾皮质中的表达显著升高
1.1iRhom2在WT小鼠的各个器官组织和肾脏不同细胞系中的表达分布
WB实验结果显示iRhom1，iRhom2在WT小鼠的心，肝，脾，肺，肾，脑，小肠及胃中均有表达，iRhom2在肾脏中有相对较高表达，提示其可能在肾脏功能调控中可能发挥重要作用。同时检测iRhom1，iRhom2在肾脏各实质细胞中的表达，WB结果显示与小鼠巨噬细胞系RAW相比，iRhom2在MPC细胞中有相对较高表达。
1.2iRhom2在2型糖尿病模型及高脂诱导的肾脏损伤模型中的表达显著升高
RT-qPCR结果显示自发性2型糖尿病db/db小鼠肾皮质中，Rhbdf2mRNA的表达与db/m组相比显著升高，而Rhbdf1的表达无明显变化;WB的结果进一步表明iRhom2表达显著升高，免疫组化结果也验证了自发性2型糖尿病db/db小鼠iRhom2的表达显著升高，并且主要表达在肾小球中。HFD诱导的肾脏损伤模型对小鼠肾脏皮质进行RT-qPCR检测，结果显示与对照相比，HFD诱导的肾脏损伤模型小鼠肾皮质中的Rhbdf2mRNA表达显著升高，而Rhbdf1mRNA的无明显变化;WB及免疫组化结果进一步验证iRhom2蛋白水平显著升高，且iRhom2的表达升高主要在肾小球。
1.3iRhom2在体外模拟糖尿病肾病条件刺激的足细胞中表达显著升高
WB实验结果显示iRhom2在15mM，30mM浓度的HG刺激下蛋白表达水平均明显升高，其中在30mM条件下升高更显著，后期体外HG刺激选用此浓度。WB结果进一步显示，其他模拟体内糖尿病诱发因素如AGEs、PA、胆固醇、oxLDL均可诱导足细胞内iRhom2的蛋白表达升高，并呈剂量依赖性。
1.4.高糖刺激肾脏实质细胞iRhom2表达变化
WB结果显示，在高糖刺激条件下肾小球内皮细胞(GENC)中iRhom2相比于甘露醇对照组蛋白表达水平有升高趋势，但无统计学意义，而系膜细胞(RMC)和肾小管上皮细胞(NRK-52E)中iRhom2蛋白水平均无明显变化。
第二部分:iRhom2在糖尿病肾病中的作用及机制研究
1.iRhom2在2型糖尿病肾病及高脂诱导的肾脏损伤模型中的作用
1.1体内动物实验中敲除Rhbdf2对2型糖尿病肾病及高脂诱导的肾脏损伤模型的影响
1.1.1Rhbdf2敲除可以减轻db/db小鼠肾小球足细胞损伤。尿微量白蛋白检测统计结果显示Rhbdf2敲除可以明显减轻db/db小鼠的尿微量白蛋白水平。PAS染色结果显示Rhbdf2敲除可以显著减轻db/db小鼠肾小球系膜基质增生、基底膜增厚。Nephrin、Podocin、Desmin及uPAR免疫荧光染色结果显示Rhbdf2敲除可显著的减轻db/db小鼠的足细胞损伤。
1.1.2足细胞特异性Rhbdf2敲除可以减轻HFD诱导的肾脏损伤小鼠中足细胞的损伤。对podo-cre+/-/Rhbdf2fl/fl鼠肾脏的石蜡切片进行PAS染色，结果显示足细胞特异性Rhbdf2敲除可以显著的改善HFD诱导的肾小球系膜基质增生、基底膜增厚形态学改变，Nephrin、Podocin、Desmin及uPAR的免疫荧光染色实验进一步证明足细胞特异性敲除Rhbdf2可显著减轻HFD引起的足细胞损伤。
1.2基因沉默Rhbdf2可以减轻HG引起的足细胞损伤
WB结果显示siRNA-Rhbdf2转染可显著抑制MPC中iRhom2蛋白表达，部分恢复HG刺激引起的Nephrin表达水平下降及uPAR表达水平的升高，对足细胞起到保护作用。
2.iRhom2可能通过调控足细胞中脂质沉积促进足细胞损伤
2.1Rhbdf2缺失减少db/db鼠及高脂喂养小鼠肾小球中脂质沉积
油红O结果显示，全身敲除Rhbdf2或足细胞特异性敲除Rhbdf2可显著减少db/db鼠及高脂喂养小鼠肾小球中的脂质沉积。Adipophilin和Synaptopodin荧光双标实验进一步表明Rhbdf2的缺失可减少足细胞中脂质沉积。
2.2沉默Rhbdf2减少MPC细胞中脂质沉积
油红O实验结果显示沉默Rhbdf2可显著降低高糖刺激引起的足细胞脂质蓄积。WB结果显示沉默Rhbdf2可部分逆转高糖刺激引起的SREBP2剪切水平升高，提示iRhom2可能通过促进SREBP2的剪切引起足细胞脂质蓄积。
结论与创新性:
1.2型糖尿病肾病db/db小鼠及高脂诱导的肾脏损伤模型中，iRhom2在肾皮质中的表达显著升高，基因敲除Rhbdf2减轻db/db小鼠足细胞损伤，进一步通过构建足细胞特异性敲除小鼠podo-cre+/-/Rhbdf2fl/fl并构建高脂诱导的肾脏损伤小鼠模型，发现足细胞特异性敲除Rhbdf2显著减高脂引起的足细胞损伤。iRhom2可能通过促进SREBP2的剪切引起足细胞脂质蓄积，导致足细胞损伤。
2.本实验通过动物实验及体外细胞实验首次探讨了iRhom2促进2型糖尿病肾病及高脂诱导足细胞损伤，并发现其可能通过调控足细胞中脂质沉积促进足细胞损伤，为糖尿病肾病的防治提供潜在的新靶点，具有重要理论意义和潜在的应用价值。