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4-羟基异亮氨酸（4-HIL）是一种治疗糖尿病的潜力药物。目前生产4-HIL比较简易的方式是以L-异亮氨酸（Ile）、α-酮戊二酸（α-KG）、以及O2为底物,经L-异亮氨酸双加氧酶（IDO）的催化生成4-HIL。实验室前期工作中将ido基因导入产Ile的谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01中进行表达,获得菌株SN02,实现了4-HIL的从头合成。本课题利用核糖体结合位点（RBS）对ido及相关基因的表达进行优化和微调,并截断丙酮酸节点的部分支路途径来改善重组谷氨酸棒杆菌中4-HIL的合成。主要的研究内容和结果如下:1、为了提高ido的表达,构建了18个不同的RBS序列（R1-R18）引导的ido表达菌株n I。发酵结果表明:与R0引导的ido表达菌株SN02相比,5个菌株的4-HIL产量增加,13个菌株的4-HIL产量发生不同程度地降低。其中菌株8I的4-HIL产量最高,为104.22±0.53 mM,比对照菌株SN02的4-HIL产量（94.83±3.22 m M）提高了9.9%,而且其IDO酶活也提高了9.4%。2、草酰乙酸是Ile和α-KG的共同前体。为了加强OAA的回补,在菌株8I中共表达由7种不同强度的RBS引导的ppc,构建7个菌株8I-nP。发酵结果表明:只有菌株8I-0P的4-HIL产量超过出发菌株8I,为115.24±4.10 m M;其余的ppc共表达菌株的4-HIL产量则降低了50.5%-64.2%,Ile大量积累。3、解除磷酸化的Odh I蛋白可以抑制α-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性。为了增加α-KG的供应,在菌株8I中共表达由6种不同强度的RBS引导的odhI,构建6个菌株8I-nO。发酵结果表明:6个菌株的4-HIL产量均比出发菌株8I低,其中菌株8I-10O的4-HIL产量比8I下降了18.7%,而8I-15O和8I-11O的4-HIL产量极低;另外3株菌的谷氨酸（Glu）产量大幅提高,说明过量的α-KG被用来合成Glu。4、透明颤菌血红蛋白VHB可以提高细胞的摄氧速率。为了提高菌株8I-nO的O2供应,在3株菌8I-15O、8I-10O和8I-11O中共表达vgb,构建3个菌株8I-nO-V。发酵结果表明:与各自的出发菌株相比,3株菌的4-HIL产量出现剧烈反转,菌株8I-15O-V和8I-11O-V的4-HIL产量分别增加到119.27±5.03 mM和86.46±1.07 mM,而8I-10O-V的4-HIL产量极低。5、为了减少4-HIL合成的副产物丙氨酸（Ala）,敲除合成Ala的氨基酸转氨酶编码基因avtA,并构建菌株Δavt A-8I-0P和ΔavtA-8I-15O-V。发酵结果表明:两株菌的Ala产量均下降了80%左右,并且4-HIL的产量分别提高到123.91±3.97 mM和122.16±5.18 mM。6、为了减少丙酮酸节点的其它副产物,敲除乳酸脱氢酶和丙酮酸激酶2编码基因簇ldhA-pyk2,然后构建菌株ΔldhAΔpyk2-8I-0P和ΔldhAΔpyk2-8I-15O-V。发酵结果表明:两株菌的乳酸和乙酸以及Ala的产量均有所下降,并且两株菌的4-HIL产量分别提高到118.33±5.67mM和139.82±1.56 mM。