论文部分内容阅读
目的:研究再生静电纺丝素纳米纤维导管能否为面神经修复提供适宜的再生微环境,促进和引导面神经再生,探讨其成为面神经缺损桥接替代物的可行性,为临床应用提供实验依据。方法:首先采用静电纺丝方法制备再生丝素纳米纤维网:直径305±84nm,呈纤维状三维立体结构,纤维分布均匀横向排列;其次制备再生静电纺丝素纳米纤维导管:导管内径1.5mm,0.2mm厚。最后上述材料经乙醇处理、蒸馏水三次洗涤和辐照后备用。1.体外实验:施旺细胞培养:取出生1~2d的新生SD大鼠背根脊神经节(DRG),Hanks缓冲液内剥离外膜,双酶消化后以1×105/孔密度接种在制备好的丝素蛋白膜(SF)和多聚赖氨酸(PLL)包被的35mm培养皿上,倒置相差、激光共聚焦、扫描电子显微镜下观察施旺细胞粘附、生长、迁移情况,并分别对施旺细胞增殖活力(MTT试验)及其分泌三种神经营养因子(CNTF、BDNF、NGF)的蛋白表达水平(ELISA)进行测试。2.体内实验:建立SD大鼠面神经损伤修复模型:横断右侧面神经形成5mm缺损;自体面神经、再生静电纺丝素纳米纤维导管分别桥接5mm缺损的面神经,3月后进行再生面神经功能评估,包括Flurogold(FG)逆行追踪、面神经电生理测试及再生髓鞘厚度、直径的测定。结果:1.从倒置相差、激光共聚焦、扫描电子显微镜结果来看:与对照组(PLL)相比,305nm再生静电纺丝素纳米纤维更适合大鼠施旺细胞的贴附、增殖、生长,对细胞迁移起引导作用,在静电纺丝素蛋白纳米纤维上施旺细胞间的排列更有序、细胞突起彼此能够形成更广泛、复杂的网状突触连接;而因为没有丝素蛋白纳米纤维支持,在PLL上的细胞排列相对简单、分布随机,突触间连接距离相对短;MTT和ELISA结果表明该材料对施旺细胞增殖活力及分泌三种神经营养因子(CNTF、BDNF、NGF)的功能没有影响。2.该材料制成的导管植入SD大鼠体内无明显不良反应,3个月就已经完全被吸收降解,缺损的面神经穿过导管重新连接在一起;从移植3月后进行神经电图(ENOG)所监测面神经复合动作电位(CMAPs)的波幅及潜伏期变化情况,可以看到面神经功能得到一定程度的恢复,尽管材料组的CMAPs波幅明显低于正常对照组,但与自体面神经移植组相比,CMAPs波幅和潜伏期方面没有显著统计学差异(P>0.05);超微结构发现两实验组再生髓鞘的厚度和直径无显著统计学差异(P>0.05);我们在材料及自体面神经移植组移植同侧的大鼠脑干面神经核团内发现荧光金逆行示踪剂出现,而阴性对照组(神经切断未再生)的面神经核团内未见荧光金逆行示踪剂出现,比较两实验组有荧光金标记的面运动神经元数量无显著性统计学差异(P>0.05)。结论:再生静电纺丝素纳米纤维能够为施旺细胞的黏附、生长、迁移提供良好的生长表面,丝素纤维的分布与走向对细胞的黏附、铺展、分布、突起方向及迁移起引导作用,从而为神经轴突的生长提供更适宜的生长通道,引导和促进轴突的定向生长;静电纺丝素纳米纤维导管能引导再生面神经通过缺损区域与远端连接,再生面神经的功能可以得到部分恢复,能够取代自体神经移植修复面神经缺损,具有潜在的临床应用价值。