论文部分内容阅读
目的:1.探索孕酮是否可以促进内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）的血管生成能力,以及孕酮受体在这一调控过程中所起的作用。2.探索CXCL12/CXCR4（CXC chemokine ligand 12/CXC chemokine receptor 4）信号通路是否参与孕酮促进内皮祖细胞活性的过程。3.评估去骨瓣减压术在治疗重型脑创伤中的作用和预测预后的临床指标。方法:1.内皮祖细胞源于骨髓单核细胞。内皮祖细胞的鉴定使用的是Willebrand Factor（vWF）,CD31,kinase domain receptor（KDR）和CD34染色,以及吞噬乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL）的实验。在Matrigel胶上平铺细胞来检测内皮祖细胞的血管形成能力。分别使用不同浓度的孕酮(0,10-10M,10-9M,10-8M,10-7M)或加入10-6M醋酸乌利司他（ulipristal acetate,UPA,孕酮受体阻滞剂）来孵育内皮祖细胞。利用成管,粘附,迁移实验来鉴定内皮祖细胞的血管生成能力。内皮祖细胞分泌的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）含量通过ELISA技术来检测。利用Western blot的方法检测孕酮受体的表达。2.使用不同浓度的孕酮（5,10 and 100nM）来孵育内皮祖细胞。通过MTS实验来检测内皮祖细胞的活性。细胞分泌的CXCL12含量利用ELISA技术来检测。分别提取内皮祖细胞膜以及细胞质中的蛋白,并使用Western blot来检测CXCR4的含量,同时使用细胞流式技术进一步确认细胞膜上CXCR4的含量。利用CXCR4阻滞剂AMD3100和phosphatidylinositol 3-kinases（PI3K）阻滞剂LY294002来探索相关信号通路在孕酮促进内皮祖细胞活性中的作用。CXCL12,CXCR4,Akt和pAkt（phosphorylated Akt,也称为protein kinase B）的含量均由Western blot方法来检测。直接使用CXCL12孵育内皮祖细胞来验证其是否有促进细胞活性的作用。3.根据患者治疗方式的不同,将重型脑损伤患者分为手术组和保守组。从2010年到2014年,根据格拉斯哥评分（Glasgow Coma Scale,GCS）,有112名接受去骨瓣减压术的患者和111名保守治疗的患者收纳到本研究中。使用拓展的格拉斯哥预后评分来评估患者的预后。并使用单因素分析法和接受者操作特征曲线来探索预测预后的指标。结果:1.培养细胞14天后,细胞呈现出均匀的,鹅卵石般的外形并具有成管能力。使用vWF,CD31,KDR和CD34对内皮祖细胞进行染色,同时使用吞噬DiI-acLDL的实验,验证了培养的细胞为内皮祖细胞。10-10,10-9和10-8M的孕酮增进内皮祖细胞成管的数量以及管壁长度并在孵育6小时后达到峰值,并且10-9M是孕酮的最佳孵育浓度。孕酮可以促进内皮祖细胞其它与血管形成相关的能力,例如粘附和迁移能力,并且可以增加VEGF的分泌。高浓度的孕酮(10-7M)则会损伤内皮祖细胞的血管形成能力。Western blot结果显示10-9M孕酮增加孕酮受体的表达,10-7M孕酮降低孕酮受体的表达。10-6M UPA会抑制孕酮对内皮祖细胞的调节作用。2.孕酮调控内皮祖细胞的活性呈现出时间及计量的依赖性。低浓度的孕酮（5nM和10nM）在孵育细胞6小时后明显增加内皮祖细胞的活性,并于12小时达到顶峰。5nM为孕酮促进内皮细胞活性的最佳浓度。100nM的孕酮对内皮细胞的活性有损害作用。孕酮能够显著的增加CXCL12的表达,而非CXCR4。Western blotting和流式的结果显示:在孕酮孵育后,细胞膜及细胞质中的CXCR4含量均没有改变。在使用CXCR12（10–120ng/ml）孵育内皮祖细胞6小时后,细胞的活性明显上升,并有一定的浓度依赖性。孕酮也可增加pAkt的表达水平。AMD3100和LY294002可以明显阻滞孕酮对内皮祖细胞活性的促进作用,同时也可阻止pAkt的表达。单独使用阻滞剂对细胞的活性没有损害。3.和保守组相比,手术组患者的死亡率更低,但是预后并没有差别。在手术组中,GCS评分,血小板,中性粒细胞数,总蛋白和白蛋白与患者预后相关;GCS评分和白蛋白是独立的预测预后的指标。在保守组中,瞳孔对光反射与预后相关,而且是独立的预测预后的指标。4.结论:1.孕酮可以在短时间内促进内皮祖细胞的血管生成能力。并且此过程可能是通过经典的孕酮通路实现的。2.孕酮能增加内皮细胞的活性以及CXCL12的表达。CXCL12/CXCR4/PI3K/Akt信号通路参与这一调节过程。3.去骨瓣减压术可有效降低重型脑创伤患者死亡率。对于不同治疗方案预测预后指标的了解,有助于准确的预知患者预后。