胡黄莲苷Ⅱ在肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的研究

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目的:探讨胡黄莲苷Ⅱ对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其与自噬、炎症反应、氧化应激的关系。方法:将40只SD大鼠随机分成4组(n=10):假手术组(Sham)、肾缺血再灌注损伤组[Renal ischemia/reperfusion(I/R)injury]、胡黄莲苷Ⅱ处理组(PicrosideⅡ+I/R)以及胡黄莲苷Ⅱ+3-甲基腺嘌呤处理组(PicrosideⅡ+3-MA+I/R)。在Sham中,经腹部正中切口开腹后充分暴露大鼠右肾后行右肾切除术,不作其余处理;在I/R组中,手术过程同Sham组,但在切除右肾后充分分离暴露左肾,用无创血管夹阻断左肾动静脉45min后松开血管夹,关腹,再灌注24h,建立动物缺血再灌注损伤模型;PicrosideⅡ+I/R组中,手术过程同肾缺血再灌注损伤组,但在缺血后再灌注之初予以胡黄莲苷Ⅱ(10mg/kg)进行腹腔注射;在PicrosideⅡ+3-MA+I/R组中,手术过程同肾缺血再灌注损伤组,但在缺血前30min腹腔注射3-MA(30mg/kg),且在缺血后再灌注之初予以胡黄莲苷Ⅱ(10mg/kg)进行腹腔注射。各组在再灌注24h后,经下腔静脉采集2ml血液标本,离心分离血清,用试剂盒检测血清肌酐(Creatinine,Cr)和尿素氮(BUN),评估肾功能;采血完成后立即切除左肾,一部分保存于10%甲醛中,另外一部分立即放入液氮中保存以便进行相关实验检测,再留取约1mm~3组织置于2.5%戊二醛固定;H&E染色后在光学显微镜下观察大鼠肾脏组织病理损伤程度;Western Blot检测各组大鼠肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3I表达水平;RT-PCR检测各组大鼠肾脏组织中炎性因子TNF-α和IL-6评估炎性反应;试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平评估氧化应激程度;电子显微镜下观察自噬溶酶体数量和形态。结果:与假手术组相比,肾缺血再灌注损伤组大鼠血清肌酐和尿素氮浓度明显升高,经胡黄莲苷Ⅱ预处理后肌酐和尿素氮浓度较缺血再灌注损伤组明显下降,而胡黄莲苷Ⅱ和3-MA联用后,血清肌酐和尿素氮浓度较胡黄莲苷Ⅱ处理组明显升高。同时,假手术组大鼠肾组织无明显病理损伤,而肾缺血再灌注损伤组大鼠肾组织病理损伤明显,经胡黄莲苷Ⅱ预处理后组织病理损伤较肾缺血再灌注损伤组明显减轻,胡黄莲苷Ⅱ和3-MA联用后,组织损伤较胡黄莲苷Ⅱ预处理组明显加重。在肾缺血再灌注损伤组中,LC3Ⅱ/LC3I和Beclin-1表达水平较假手术组升高,经胡黄莲苷Ⅱ预处理后LC3Ⅱ/LC3I和Beclin-1表达水平进一步升高,而胡黄莲苷Ⅱ和3-MA联用后LC3Ⅱ/LC3I和Beclin-1表达水平明显下降。与假手术组相比,肾缺血再灌注损伤引起TNF-α和IL-6明显升高,胡黄莲苷Ⅱ预处理后TNF-α和IL-6明显下降,胡黄莲苷Ⅱ和3-MA联用后,TNF-α和IL-6明显升高。与假手术组相比,肾缺血再灌注损伤组中大鼠SOD明显下降,MDA明显升高,胡黄莲苷Ⅱ预处理后SOD下降,MDA升高,胡黄莲苷Ⅱ和3-MA联用后SOD明显下降,MDA明显升高。在假手术组不能发现明显的自噬溶酶体形成,缺血再灌注损伤可形成少量自噬体,胡黄莲苷Ⅱ预处理后大鼠肾组织中可见大量自噬体,胡黄莲苷Ⅱ和3-MA联用后自噬体数量明显减少。结论:胡黄莲苷Ⅱ能够有效减轻肾缺血再灌注损伤,其机制可能与激活自噬,减轻炎症反应和氧化应激有关。
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