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萤火虫荧光素酶(LUC，EC1.13.12.7)是生物体内能催化荧光素氧化发光的一类酶。在Mg2+，ATP和O2存在的条件下，荧光素酶能催化D-荧光素氧化脱羧将化学能转变成光能，发出黄绿色荧光。荧光素酶具有特异性好、灵敏性高、操作简便、反应迅速、对生物体无毒害作用等诸多优点，因此被广泛应用于微生物探针、分子生物学、食品卫生检测、环境监测、药物筛选等相关领域。但由于荧光素酶的稳定性较差，高温下容易失去活性，很多基于荧光素酶检测的应用受到了限制。因此，进一步提高荧光素酶的稳定性具有重要的应用前景和现实意义。本研究以源自北美萤火虫（Pho tin us pyralis）的荧光素酶为研究对象，利用分子生物学手段对酶进行改造，以期获得热稳定性较好的荧光素酶。本研究的主要研究内容和结果如下: 1.采用易错PCR扩增来源于萤火虫的荧光素酶基因片段，获得了17个随机突变体。利用分子动力学模拟技术对这17个随机突变体进行B-factor分析，发现有4个突变体的B-factor值增加，推测这4个突变体可能具有较好的热稳定性。进一步通过分子模拟发现，其中的E354K突变体具有较低的RMSD值、Rg值，且发现突变体354位的赖氨酸位点及311位的谷氨酸位点引入了新的盐键，推测突变体E354K具有较好的热稳定性。采用定点突变的方法获得了突变体E354K，通过对野生型和突变体的热稳定性分析发现:突变体E354K的半衰期、T50较野生酶分别提高了76 min和4.5℃，但突变体E354K的催化效率较野生型有所下降。 2.为进一步提高荧光素酶的热稳定性，在荧光素酶的N、C末端分别添加SpyCatcher和SpyTag，利用SpyCatcher/SpyTag的之间可以快速不可逆的形成共价键这一特性，实现荧光素酶的体内环化。通过对比野生酶和环化酶的酶学性质发现:环化后的荧光素酶在45℃的半衰期为40.3 min，是野生型的2.4倍;环化酶的T50和Tm比野生酶分别提高了10.1℃和16.7℃，分别达到了47.5℃和70.2℃;并且，环化酶的活力为103％，与野生酶的活力(100％)基本一致。此外，环化酶的最适反应温度和最适pH分别达到了35℃和9.0，野生酶的为25℃和8.0。在酶的pH稳定性方面，在pH8.0-10.0的范围内环化酶几乎保持100％的酶活力，而野生酶在pH10.0时只有80％的酶活力。 3.为提高环化荧光素酶的表达量，对环化荧光素酶的诱导表达条件进行了优化，分别考察培养基初始pH、诱导时间、诱导温度、摇床转速、诱导剂(IPTG)添加量和接种量对荧光素酶表达的影响，最优的表达条件为:培养基初始pH7.0，接种量4％，IPTG终浓度1.0 mM，诱导时间5h，诱导温度30℃，摇床转速180 rpm。结合正交实验对上述培养条件进行优化，获得最佳的培养条件:培养基初始pH7.0，接种量为1％，诱导温度为30℃，摇床转速为200 rpm，在此条件下，荧光素酶表达量最高。