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随着社会经济的不断发展和人口的增长,人类对能源的需求与日俱增,燃料乙醇作为一种清洁的可再生能源成为关注热点。利用丰富而廉价的纤维素资源代替粮食淀粉生产燃料乙醇对社会的可持续发展具有重大意义。但纤维素酶解效率低、纤维素无法被充分利用等问题成为纤维素乙醇生产大规模发展的障碍。本论文针对上述现状,从构建同时糖化发酵的重组菌和构建利用木糖、葡萄糖共发酵的重组酿酒酵母出发,进行了以下研究:
利用酵母表面展示技术,将纤维素酶在酿酒酵母表面固化表达,构建可以利用纤维素原料进行发酵生产乙醇的重组酿酒酵母。将克隆自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C-9的内切纤维素酶(EGX)与α-凝集素小亚基编码蛋白Aga2p融合,连接入酵母整合载体Ylp5,为实现纤维素酶在酿酒酵母中高效、稳定的表达,将融合蛋白置于酵母强启动子PGK的控制之下,同时,将融合蛋白整合入酿酒酵母染色体rDNA区域,大大提高外源基因在宿主细胞中的拷贝数。免疫荧光、免疫点杂交及酶活分析结果表明:EGX已成功在酿酒酵母表面表达;将重组酿酒酵母在以羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基中进行发酵,结果表明:重组菌可以利用纤维素碳源并生成乙醇,经过55 h的发酵,乙醇产量可达3.92 g·L-1;由于整合入酵母染色体中,外源基因在宿主细胞中的稳定性增加,即使连续培养60世代egX基因仍可稳定存在于宿主细胞中。
木糖是纤维素水解液中含量仅次于葡萄糖的一种单糖,它的充分利用是提高纤维素原料利用率的关键。传统的乙醇发酵菌株酿酒酵母不能利用木糖,但可利用其异构体形式-木酮糖。在酿酒酵母中引入木糖还原酶基因(xyl1)和木糖醇脱氢酶基因(xyl2),可开辟木糖代谢途径,构建可利用木糖进行发酵生产乙醇的重组菌株。但由于两种酶所需辅酶不同,常导致重组细胞内氧化还原失衡,造成中间产物的积累。本文利用定点突变技术,对来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖醇脱氢酶(PsXDH)进行突变,在一定程度上改变了其辅酶特异性。
为构建可利用木糖的重组酵母,将树干毕赤酵母木糖异构酶、木糖醇脱氢酶(突变体)及酿酒酵母内源木酮糖激酶分别置于PGK启动子之下,构建了rDNA介导的多拷贝整合和URA3介导的单拷贝整合的重组质粒,并转化到酿酒酵母W303-1A中,得到重组酵母SXYL123-rDNA,SXYL123-rDNA,SXYL123和SMXYL123。荧光定量PCR分析结果表明:与URA3介导的单拷贝整合相比,rDNA介导的多拷贝整合载体使外源基因的拷贝数提高了16倍;沉默信息调节因子Sir2p对rDNA区域的同源重组具有抑制作用,利用Cre/LoxP系统将酿酒酵母中sir2基因的编码区敲除掉,然后将rDNA介导的多拷贝整合质粒转化入sir2基因敲除的酿酒酵母中,构建重组菌△SMXYL123-rDNA。结果表明,sir2基因的敲除使rDNA区域的整合率提高了4倍。将重组菌进行葡萄糖和木糖共发酵实验,结果表明:与对照菌株相比,重组菌的木糖利用能力及乙醇产率均有所提高,木糖醇脱氢酶的突变减少了中间产物木糖醇的积累;其中重组菌△SMXYL123-rDNA表现出最高的木糖利用率和乙醇产量,分别达到79.4％和7.22 g·L-1;代谢中间产物的分析表明,重组菌△SMXYL123-rDNA木糖醇积累量减少了35.6%。