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肉色是畜肉中十分重要的品质指标之一,可直观反映生鲜肉品质的优劣,影响消费者购买欲望。肉色主要来自肌细胞内呈色蛋白质-肌红蛋白(Myoglobin,Mb),因而解析Mb的分子结构信息,开发一种准确、快速的肉色评定方法对于消费者和肉品工业有着重要的意义。本文分离出猪心肌高铁肌红蛋白(Pig metmyoglobin,pMetMb),运用生物质谱和分子信息学技术,全面解析它的分子信息和结构特征;运用现代免疫学理论和技术,制备具有高特异性的pMetMb单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAb)和多克隆抗体(Polyclonal antibodies,PcAb),建立肉色pMetMb快速诊断的夹心ELISA方法;并得到以下结论1 pMetMb分子结构信息纯化后pMetMb为棕红色,17kDa表观分子量,是含有一条多肽链和一个卟啉环(Heme-Fe2+/3+)的单亚基球状蛋白质。它的肽链长度不少于133氨基酸(Amino acids,AAs),至少由15种AAs组成,它的AAs种类、数量和比例与马心肌肌红蛋白(Horse myoglobin,hMb)吻合度高达90%左右,而它的5个肽链片段与野生型猪Mb(gi|494385)序列匹配度达79.9%(置信度100%,P<0.01);经一级结构比对证实,pMetMb与哺乳类动物Mb为高度同源蛋白质。它仅有三级结构,二级结构中含有7个α螺旋和2个310螺旋,由于310螺旋结构导致盘旋的球状体更加致密且稳定,更有利于电子传递和肉色稳定等生物学功能的表达;同时观察到它的heme-Fe2+/3+镶嵌于第6和7螺旋的His64和His93位,与咪唑基团中Im N-形成配位键,在不同键合形态下完成Fe2+/3+氧化还原反应和肉色的表达。由于pMetMb是肉色的主要呈色物质,因此可用于建立新的快速肉色诊断方法的材料。2 pMetMb单克隆抗体和多克隆抗体的制备选用新西兰兔背部皮下多点注射免疫,4次免疫后获得多克隆抗血清(PcAb);通过检测,它与pMetMb可产生特异性反应,其效价高达1×105以上;选多只BALB/c小鼠,同样背部皮下多点注射免疫,4次免疫后取脾细胞与杂交瘤SP2/0细胞融合,得到4株特异性McAb细胞;用4F2细胞制备小鼠腹水,效价达1×105以上后纯化,并用于肉色pMetMb夹心ELISA方法的研究。3肉色夹心ELISA方法以纯品pMetMb为抗原,经研究确定了“单抗/底层-抗原-多抗/上层”模式。在模式下的适宜ELISA工作条件为,4μg/mL McAb-1%酪蛋白/60min-pMetMb/90min-4μg/mL PcAb/90min-1:4000(V:V)二抗/45min,其中除 McAb 需 4℃C过夜外,其它反应温度均设置为37℃。该模式中pMetMb抗原标准曲线,在0.04-5.120μg/mL pMetMb范围内,浓度对数值与OD值呈良好的线性关系;Y=0.4959X-0.5788,R2=0.9919(P<0.01);pMetMb检测基线为0.027μg/mL(±3SD),总回收率100.5%;批次间数值稳定且无差异(P^0.05),而浓度梯度间差异极显著(P<0.000);初步表明该模式建立的肉色夹心ELISA法稳定,灵敏度和精确度高。进一步选13个猪肉样本,检测该模式的可靠性。结果表明,肉样中加入3浓度pMetMb,并以PBST和人HMb为对照,pMetMb回收率86.0%-87.3%,批次间无差异(P>0.05),浓度梯度间差异极显著(P<0.05),证实该肉色评价方法是可靠的。