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法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官,它为禽类B细胞的发生与发育提供了必要的微环境。随着法氏囊的发育,B细胞在法氏囊中经历增殖、分化与迁移,95%的B细胞最终凋亡,然而导致禽类囊B细胞凋亡的原因与具体机制尚不清楚。本研究拟以农华麻鸭胚胎期与孵化后早期的法氏囊为研究对象,首先通过HE染色筛选出在法氏囊组织形态结构上具有代表性的囊B细胞发育时期;通过高通量测序技术获取鸭发育早期法氏囊中的基因表达量,分析各阶段差异表达基因来探索鸭胚法氏囊中B细胞凋亡的分子基因和内平衡调控;同时,分析鸭法氏囊早期发育过程中先天免疫基因的表达以探索先天免疫相关基因在鸭发育早期法氏囊中的功能,为鸭的免疫系统发育及抗病育种提供参考。试验结果如下:鸭法氏囊的HE染色显示,在ED14时,法氏囊中已经形成两个大的粘膜褶皱;在ED22时,法氏囊中形成了淋巴滤泡;在D1时,法氏囊中淋巴滤泡的皮层和髓质层可以被明显区分。3个时期间法氏囊长度均呈极显著性差异(P<0.01)。转录组测序结果显示在鸭法氏囊中的ED14-ED22、ED14-D1和ED22-D1阶段分别筛选到8083、8962和1682个差异表达基因。各阶段差异表达基因的KEGG聚类分析表明:在三个阶段总被富集的通路“免疫球蛋白产生的肠道免疫网络”和“细胞因子-细胞因子受体相互作用”可能对于法氏囊的发育必不可少;Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路和MAPK信号通路可能参与调控B细胞的增殖与分化;Ras信号通路和血管紧张素系统可能与B细胞迁移相关。免疫荧光双标试验证明在ED22和D1的法氏囊滤泡和FAE中存在B细胞凋亡的现象;“apoptosis”通路也在ED14-ED22和ED14-D1阶段被显著富集(P<0.05);并且Caspase-3、Caspase-7和Bcl-2的表达量在ED14-ED22阶段有显著性变化(P<0.01)。这些结果表明:在ED14-ED22阶段,B细胞的凋亡首次在鸭法氏囊中发生。差异表达基因的富集分析结果显示:凋亡的固有途径和外在途径被显著富集(P<0.05);高通量测序和RT-PCR结果共同证明Bim、Bax、Bak、Cyt c、Caspase-8、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-6、Fas、CD40、CD40LG和Bid表达量在ED14-ED22阶段发生显著性变化(P<0.01)。同时,TRAIL信号通路及其关键基因(TRAIL、P53、TRAF6)在ED14-ED22和ED14-D1阶段被显著富集(P<0.05)。此外,在ED14-ED22阶段差异表达的凋亡相关基因的蛋白互作分析结果显示IGF-1、BMP4和FOXO1可能调控了囊B细胞的凋亡。最后,在ED14-ED22阶段,显著富集的DSBs、EBR和原发性免疫缺陷通路(P<0.01)暗示B细胞错误分化可能导致B细胞的基因缺陷。在鸭胚胎期法氏囊中检测到TLRs、NLRs和RLRs模式识别受体的表达。高通量测序、RT-PCR和WB结果显示:在鸭胚胎阶段,RIG-Ⅰ的表达量随着法氏囊的发育逐渐增加。在ED14时,RIG-Ⅰ主要分布在法氏囊的粘膜;在ED22、D1和W1时,RIG-Ⅰ主要分布在法氏囊的FAE和滤泡中间层。同时,在ED22、D1和W1时,表达的RIG-Ⅰ和成熟的B细胞共同位于细胞外膜。转录组数据的蛋白互作分析发现:TRIM25、RNF135和DHX58可能诱导激活RIG-Ⅰ表达;同时,在HEK293T细胞中,通过荧光素酶报告系统试验证明RXR-alpha-like和AP1是鸭RIG-Ⅰ的转录因子,它们可以上调RIG-Ⅰ的表达。最后,RT-PCR试验发现鸭胚法氏囊中表达的RIG-Ⅰ不能诱导下游信号通路激活。综上所述,在ED14-ED22阶段,B细胞的凋亡首次在鸭法氏囊中被观察到。囊B细胞的凋亡被线粒体和Fas信号通路介导,这可能是TRAIL所致;同时,BMP4、FoxO1和IGF-1可能参与调控囊B细胞的凋亡;囊B细胞的错误分化可能是导致囊B细胞凋亡的根本原因之一。此外,随着法氏囊的发育,其先天免疫功能不断完善,RIG-Ⅰ在鸭胚和刚孵化雏鸭中发挥着预防病原攻击的先天免疫储备作用,暗示以RIG-Ⅰ为代表的模式识别受体的表达对于法氏囊免疫功能的完善是必不可少的一部分。