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研究目的：食管癌是有中国特色的恶性肿瘤之一。在中国的太行山区,食管癌的发病率居世界首位。虽然近年来手术及放、化疗等综合治疗方法取得较大的发展,但是食管癌总的远期生存率并没有明显改善,肿瘤局部侵袭及远处转移仍然是死亡的主要原因。肿瘤的发展过程是一个多阶段、涉及多个基因参与的复杂过程,MMP-2被认为在多种恶性肿瘤的发展过程中发挥重要作用。本研究通过构建慢病毒表达载体介导siRNA沉默MMP-2基因,观察其对人食管癌KYSE150裸小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,为食管癌的基因治疗提供实验依据。方法：1建立靶向MMP-2基因的shRNA慢病毒载体设计3个靶向MMP-2基因的siRNA序列,经Genebank数据库BLAST检索,确认设计的siRNA序列无其它同源序列。对应siRNA序列设计3个shRNA对应的DNA序列。siRNA正正义链和反义链之间以loop连接。构建重组质粒,经过酶切和测序鉴定后用慢病毒包装。将慢病毒转染目标细胞KYSE150后采用实时定量PCR方法检测干扰效果。根据干扰效果筛选干扰效果最佳的序列进行慢病毒的大量包装,纯化后用于下一步裸鼠移植瘤的实验。2细胞增殖实验噻唑蓝(MTT)法检测细胞数目和增殖、生长能力。3裸鼠成瘤预实验收集食管癌KYSE150细胞5×106个,用PBS稀释至0.1ml,于裸鼠右侧胁肋部皮下注射,构建人食管癌异种移植瘤模型。4抑制MMP-2表达对人食管癌癌细胞系KYSE150影响的体内实验24只裸鼠随机分为3组,每组8只。将含有干扰MMP-2基因片段的慢病毒及含有无关序列片段的慢病毒分别转染食管癌KYSE150细胞,转染成功后将MMP-2shRNA慢病毒转染的KYSE150细胞(实验组)、无关序列慢病毒转染的KYSE150细胞(阴性对照组)及未转染任何载体的KYSE150细胞(空白对照组)分别接种至裸鼠右侧胁肋部皮下。观察移植瘤的生长情况,肿瘤体积按公式计算,体积=1/2×长径×短径2。实验开始30天后处死裸鼠,分离皮下移植瘤计算肿瘤体积和重量。结果：1.构建了3个靶向MMP-2基因的RNA干扰慢病毒载体,经测序验证质粒构建成功。2.在目的细胞中筛选有效干扰序列,RT-PCR显示3个shRNA干扰序列对MMP-2mRNA抑制效果分别为：40.5%,41.4%,78.9%,和空白对照及阴性对照组相比MMP-2mRNA水平明显受到抑制p<0.05)；western blotting显示3个质粒干扰后MMP-2/β-actin吸光度比值分别为：0.187±0.072,0.261±0.095,0.063±0.016,和空白对照及阴性对照组比较MMP-2蛋白水平明显受到抑制p<0.05),经筛选shRNA-3为最有效的干扰序列。3.逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度,病毒滴度为4.26×108TU/ml。4.细胞增殖实验发现慢病毒介导的MMP-2基因沉默组细胞增殖能力显著低于空白对照和阴性对照组(p<0.001)。5.成功建立了裸鼠食管癌细胞系移植瘤模型。和阴性对照组和空白对照组比较,RNA干扰组的肿瘤生长明显缓慢,肿瘤体积和重量明显缩小和减轻(p<0.05)。结论：1、RNA干扰的方法可以高效地沉默食管癌细胞KYSE150MMP-2基因的表达,可作为一种基因敲除、基因治疗研究的理想手段。2、针对MMP-2基因设计的表达shRNA的慢病毒载体能在体外状态下从mRNA和蛋白水平特异、高效地抑制人食管癌细胞系KYSE150中MMP-2基因的表达,证明慢病毒是一种有效的RNAi传递载体。3、细胞增殖实验显示靶向MMP-2的慢病毒载体转染食管癌细胞系KYSE150后,引起其生长增殖速度明显减慢。4、沉默食管癌细胞中MMP-2基因的表达能有效抑制人食管癌裸鼠移植瘤的生长,国内外首次在活体条件下验证了MMP-2基因对食管癌细胞的生物学行为的影响。为下一步研究奠定了基础,MMP-2有望成为食管癌基因治疗的靶点之一。