【摘 要】
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第一部分:构建稳定过表达Lrtm1基因的C2C12细胞系目的1.构建小鼠Lrtm1基因表达载体。2.筛选稳定表达外源性Lrtm1基因细胞株。3.验证商品化Lrtm1抗体特异性。方法1.构建成肌分
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第一部分:构建稳定过表达Lrtm1基因的C2C12细胞系目的1.构建小鼠Lrtm1基因表达载体。2.筛选稳定表达外源性Lrtm1基因细胞株。3.验证商品化Lrtm1抗体特异性。方法1.构建成肌分化模型。2.诱导C2C12细胞系分化后Hoechst染色,观察肌管形成。3.C2C12细胞瞬时过表达Lrtm1、GFP质粒。4.重组表达载体pLJM1-Lrtm1-DDK的构建:(1)PCR扩增小鼠Lrtm1基因。(2)用AgeI、Eco RI酶切pLJM1-GFP载体。(3)目的片段与载体连接。5.慢病毒包装。6.构建稳定过表达Lrtm1基因C2C12细胞系。8.商品化Lrtm1抗体特异性的验证。9.观察截短体Lrtm1蛋白质位置。结果1.肌管由多个细胞融合而成。2.Real-time PCR检测到Myogenin、Myosin、Lrtm1基因mRNA水平在分化过程中升高。3.C2C12细胞瞬时转染效率低。4.成功扩增小鼠Lrtm1基因。5.pLJM1-GFP载体双酶切成功。6.成功挑选出连接Lrtm1基因的阳性克隆。7.测序重组质粒pLJM1-Lrtm1-DDK质粒结果与Lrtm1 CDS序列比对成功。8.重组质粒pLJM1-Lrtm1-DDK在HEK293T细胞中表达。9.Real-time PCR检测到C2C12-Lrtm1-DDK细胞系Lrtm1 mRNA表达水平。10.商品化Lrtm1抗体特异性识别差。11.Western blot检测到截短体Lrtm1蛋白质表达。结论1.成功构建慢病毒表达载体pLJM1-Lrtm1-DDK。2.慢病毒感染筛选到C2C12-Lrtm1细胞系。第二部分:Lrtm1基因在成肌分化过程中的功能探索目的1.诱导分化稳定细胞系后观察过表达Lrtm1基因对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin以及调控因子MYF5、MyoD、MEF2D等的影响。2.明确Lrtm1蛋白质表达水平在C2C12细胞中受调控的机制。方法1.检测Lrtm1基因对成肌分化过程的影响(1)诱导稳定细胞系分化,Real-time PCR、Western blot检测稳定过表达Lrtm1基因对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin的影响。(2)在稳定细胞系中检测成肌调控因子、PAX3、PAX7等mRNA表达水平,探索Lrtm1基因影响成肌分化过程的具体机制。2.探索Lrtm1蛋白质表达水平通路调节机制(1)C2C12-Lrtm1细胞系中,对比MG132处理,对外源性Lrtm1蛋白质表达水平的影响。(2)在C2C12、HEK293T细胞瞬时过表达外源性Lrtm1基因,对比MG132处理与否,检测外源性Lrtm1蛋白质表达水平。结果1.过表达Lrtm1基因在蛋白质水平、mRNA水平对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin的表达均有抑制作用。2.在外源过表达Lrtm1基因促进成肌分化基因PAX3、MyoD的mRNA表达水平有促进作用。3.C2C12细胞中Lrtm1蛋白质水平受蛋白酶体调控。结论1.Lrtm1基因在成肌分化过程中随分化进行表达逐渐升高。2.过表达Lrtm1基因抑制Myogenin、Myosin基因的表达。3.过表达Lrtm1基因促进PAX3基因的表达。4.C2C12细胞中Lrtm1蛋白质表达水平受蛋白酶体调控。
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