以羊膜基质为内皮细胞粘附的载体修饰血管内支架的实验研究

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为了解决血管内支架(intravascular srent,IVS)植入术后引发的再狭窄问题,国内外进行了许多相关的实验研究,主要集中在新材料的合成、材料表面的生物学改性,支架表面药物涂层和内皮细胞(endotholical cell,EC)种植等方面。最近还研制了一种覆膜支架,即支架内面或外面部分或完全覆盖不透血液的膜性材料的人工血管内移植物。覆膜支架不但具有普通支架的支撑作用,还可通过膜的机械性阻隔和膜表面的特殊物质产生防治血栓形成和内膜过渡增生的作用。目前报道覆膜血管内支架的种类主要有聚合物膜支架、药物包膜支架和生物膜支架,不同程度取得了良好的实验和临床效果,但也仍然存在着一些问题。如聚合物膜支架显著的增加了与血液接触的表面积,若处理不当,会导致更严重的血栓形成和平滑肌细胞的过渡生长;或者它们只是单纯地作为细胞粘附的基质,缺乏与细胞间相互作用的性能,并会出现膜材料的老化降解现象;药物包膜支架对药物的选择和给药方式、途径,作用时间等问题仍需进一步的探讨和改进;生物膜支架是最具发展潜力的一种覆膜支架类型,但其材料来源有限并来源途径本身会对人体造成一定的伤害。羊膜基质具有薄而透明、无抗原性,在体内可降解及可促进细胞的粘附生长和增殖等特性,并且来源广泛,可能会成为覆盖修饰血管内支架的良好的新的材料。 本实验设计以人的“去细胞”羊膜基质(human acellular amniotic membrane, HAAM)为新型 覆盖修饰血管内支架,并以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endotholical cell,HUVEC)为种子细胞来源,HAAM为细胞粘附的基质进行血管内支架的内皮化处理,以改善或解决支架植入术后的再狭窄问题。主要分三部分: ① 羊膜基质的制备与内皮细胞的培养:主要探讨了羊膜的获取、保存及“去细胞”处理的实验方法,并用MTT法对内皮细胞与羊膜浸提液的相容性进行了测定。实验结果表明,通过0.25%胰酶消化法或0.25%+0.02% EDTA混合液消化法均可完全去除羊膜上皮细胞。MTT法测定结果表明,羊膜浸提液可促进内皮细胞的生长、增殖,与内皮细胞相容性良好,无细胞毒性作用。 ② 内皮细胞的种植及其形态和功能的检测:正交实验设计得出纯甘油保存、0.25%胰酶消化和紫外线照射灭菌的方法制备的羊膜基质较适合内皮细胞的种植;通过检测NO含量,发现羊膜基质可明显促进内皮细胞分泌NO,并且得出内皮细胞密度为2.0~3.0×105个/ml时,种植细胞形态和分泌NO功能最好;最后采用流动腔测试法,比较了分别种植于羊膜基质和明胶基底上内皮细胞的粘附性,发现在不同切应力作用下,种植在羊膜基质上的细胞残留率均高于种植在明胶基底上,统计分析存在显著差异 (P<0.05或P<0.01)。 ③ 羊膜基质覆盖修饰血管内支架的实验研究:首先通过对羊膜基质力学特性的测定,发现羊膜基质具有一定的弹性,并且“去细胞”处理后的羊膜基质的最大负荷、断裂负荷、最大压力、断裂压力和模数值明显高于未处理前,两组间相比,差异显著或极其显著(P<0.05或P<0.01);然后对羊膜基质覆盖修饰血管内支架的工艺进行了研究,结果表明,羊膜可完好覆盖于支架内表面,形成光滑薄膜层;最后比较了覆膜和明胶涂层支架种植内皮细胞的粘附率,得出羊膜基质较明胶更能促进内皮细胞的粘附。 实验结果证明:人脐静脉内皮细胞可在羊膜基质上粘附生长并增殖,形态观察和功能测定均良好;羊膜基质也可完好覆盖于血管内支架的内表面,并可进行内皮细胞的体外种植。说明羊膜基质可作为新型膜材料覆盖修饰血管内支架,并以其为内皮细胞粘附的基质进行体外内皮细胞种植,有望改善或解决支架植入术后的再狭窄问题。
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