胶质瘢痕是缺血性脑卒中病理变化的必然结局。而作为其主要成分,反应性星形胶质细胞(reactive astrocytes,RACs)的形成和生物学功能直接影响脑组织结构的重建和功能恢复。深入研究病灶部位RACs形成过程中的相关分子调控机制,对于提高缺血脑组织再生修复能力意义重大。缺血性脑卒中发生后,损伤脑组织血液供应受阻,氧气和葡萄糖严重匮乏,ACs代谢产生大量乳酸在组织内积累。既往研究表明,乳酸在缺氧条件下作为代谢底物及信号分子发挥了重要的神经保护及免疫调节功能,然而其中具体机制还未完全阐明。而缺血性脑卒中过程中乳酸信号对ACs的生物学作用至今鲜有报道。N-myc下游调节基因2(N-myc downstream regulated gene 2,Ndrg2)是ACs特异性标志物,且与ACs增殖、活化、炎症反应及凋亡等功能密切相关,在发生缺血性脑卒中的脑组织形成的RACs中表达增加,其表达是否受到乳酸调控以及乳酸通过NDRG2对RACs的产生和生物学功能的影响尚未见报道。本研究旨在探究在氧糖缺乏条件下,乳酸通过NDRG2对RACs形成的作用和机制,为乳酸或者NDRG2为靶点的脑缺血损伤神经保护药物的开发提供理论基础和实验数据。本研究在永久性大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)动物模型观察基础上,利用氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)细胞模型,通过RT-q PCR、Western blot、免疫组织化学染色对相关基因及蛋白表达进行检测,利用RNA测序结合生物信息学分析筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)并对DEGs进行功能富集分析,探索乳酸通过NDRG2对RACs的形成和有关生物学功能发挥的作用。所得结果如下:(一)对大鼠MCAO模型脑切片,进行TTC染色,结果显示,损伤发生8h时,损伤灶面积较大且边缘清晰、损伤组织中乳酸含量与对侧对照组织相比显著增加;应用Western blot对2h、4h和8h的MCAO损伤模型脑组织ACs反应性增生标志物GFAP的蛋白表达进行分析,结果显示,损伤侧GFAP蛋白含量在8h时显著增加。上述实验提示,在发生缺血损伤的脑组织中,乳酸可能对ACs反应性增生发挥正向调节作用。(二)在体外,我们通过OGD细胞模型,应用Western blot检测到ACs的GFAP、SOX9的蛋白表达及Akt、STAT3磷酸化水平增加,以上的实验结果提示,在OGD条件下,乳酸可促进ACs发生反应性增生而形成RACs。(三)为进一步阐明乳酸通过NDRG2对RACs的形成发挥的作用,我们首先研究了乳酸对NDRG2调控作用的机制。经RT-q PCR和Western blot实验证实,乳酸对Ndrg2基因表达无影响,而显著提高其蛋白表达量,说明乳酸可能是通过转录后水平对NDRG2蛋白表达进行调控的;利用si RNA干扰ACs内负责乳酸摄取的转运体蛋白MCT1的基因表达后,细胞内乳酸含量显著降低且NDRG2蛋白表达显著下降,说明高浓度的细胞外乳酸可能通过MCT1被转运进入细胞进而影响NDRG2蛋白在细胞中的累积;通过分子对接分析预测,乳酸可与NDRG2上的氨基酸残基Asp172,Lys176,Asp180,Arg240形成氢键相互作用,进而稳定乳酸与NDRG2蛋白的相互结合作用;通过Co-IP实验证实,在OGD条件下,乳酸使NDRG2泛素化水平显著下降,即,乳酸可能通过调控细胞NDRG2泛素化水平,影响细胞内NDRG2蛋白含量。上述实验说明,在OGD和高浓度乳酸的条件下,通过MCT1进入细胞的乳酸可能以直接结合的方式抑制NDRG2泛素化降解,上调其细胞内蛋白含量。然而,随后的Western blot结果显示,OGD及乳酸处理条件下,沉默Ndrg2后GFAP、SOX9无显著差异。上述实验结果说明,OGD条件下,乳酸促进ACs发生反应性增生,使之转变为RACs,NDRG2随RACs的产生而表达增加,提示其在RACs中可能发挥相应生物学功能。(四)利用RNA测序结合生物信息学分析的手段探索OGD和乳酸处理条件下NDRG2缺失对RACs生物学功能的影响,结果显示,沉默Ndrg2基因表达后下调的功能条目多与代谢功能相关,而发生上调的功能条目多与炎症反应及免疫调节相关,说明Ndrg2沉默使ACs整体代谢水平下降,并促进炎症反应发生;通过对显著上调DEGs进行信号通路网络分析及分子互作网络分析,找到了关键节点基因Tnfα,通过RT-q PCR、Western blot及ELISA证实,Ndrg2沉默导致Tnfα基因、蛋白表达及分泌均显著增加,该趋势可以被Ndrg2过表达质粒逆转,结果提示,NDRG2负向调控Tnfα表达;GSEA基因集富集分析结果显示,凋亡相关基因集趋向于富集在Ndrg2沉默的ACs中,Western blot结果显示,Ndrg2沉默导致抗凋亡相关蛋白BCL2表达下降而该趋势可被Ndrg2过表达所逆转,Annexin-V/PI染色结果显示,Ndrg2沉默以后凋亡细胞比例显著增加,而该趋势可部分被TNFα中和抗体所抑制,该结果说明,在OGD条件下,乳酸可通过NDRG2-Tnfα轴抑制RACs凋亡,促进RACs的存活。上述实验说明,OGD条件下,乳酸信号通过NDRG2抑制TNFα等炎症因子的产生,改善损伤微环境同时促进RACs存活,并对促进和维持ACs反应性增生及胶质瘢痕形成、对损伤修复有重要意义。综上所述,本文通过OGD条件的细胞模型和大脑中动脉闭塞动物模型证实,在氧糖缺乏条件下,乳酸可促进ACs转变为RACs,且通过调控NDRG2泛素化水平进而影响细胞内NDRG2蛋白含量,发挥抑制炎症因子表达和细胞凋亡的作用,促进RACs存活,改善损伤微环境的同时,对促进和维持ACs反应性增生和胶质瘢痕形成,进一步防止损伤面积的扩大有重要意义。