化学生物传感是获取生物体系内重要化学生物信息以探索各类化学反应过程与生命现象本质的关键技术手段。而作为化学生物传感基石的荧光探针，由于与荧光成像技术结合能够方便地用于生物体系中目标分子及其生物过程的原位实时无损检测和监控，日益成为现代生命科学和疾病诊断等领域不可或缺的分子工具。然而当前科学技术的进步与发展，对传感技术提出了全新的挑战和更大的需求。荧光探针尽管近年来发展迅速且应用广泛，但在应对上述挑战和需求时，其表现却渐现疲态，在实际应用时暴露出一些较为棘手的难题。新型荧光探针的设计与应用研究仍有大量的工作有待去开展，其中的关键是必须与时俱进地提升荧光探针性能，使其能适应时代的快速发展和应对层出不穷的挑战。本论文工作以解决荧光探针面临的瓶颈问题为目的，以改善和提高荧光探针的传感与成像性能为主旨，立足于分析化学、有机化学、生物科学与纳米技术的学科交叉，针对荧光探针存在的一些缺陷相应地提出改进策略并据此设计了几例代表性的新型荧光探针用于传感与成像分析，为荧光探针的发展进步和推动其在化学生物学等研究领域的应用提供新思路和新方法。具体从三个方面开展了以下五个工作：（一）氧化石墨烯辅助内滤效应型和化学反应型荧光探针的研究与应用。(1)具有合成简单和结构性能可调等特点的内滤效应型荧光分子探针在复杂体系中应用时易受环境介质的干扰导致内滤体系的稳定性、内滤效应效率和响应性能降低等影响。针对这一问题，我们提出以性能良好的氧化石墨烯为固体介质桥联内滤效应型荧光分子探针的荧光体和吸收体两个组分构建适用于复杂体系的内滤效应型荧光纳米复合探针的解决办法。作为概念验证，我们合成了一个响应生物硫醇的比色分子探针CP并与罗丹明6G功能化的氧化石墨烯R6G-GO通过π-π堆积作用自组装形成荧光纳米复合探针R6G-GO/CP。实验结果表明：与常规的内滤效应型荧光分子探针R6G/CP相比，R6G-GO/CP的内滤效应效率和灵敏度以及响应时间都有明显的改善，并且氧化石墨烯使R6G-GO/CP在复杂生物体系中展现较好的稳定性和生物相容性，因而被成功应用于人血清样中生物硫醇的检测和细胞内生物硫醇变化的成像分析（第2章）。(2)为克服氟离子化学反应型荧光分子探针存在的响应时间长和生物成像性能不佳等缺陷，我们提出利用氧化石墨烯的催化反应和纳米载体功能加以改善的策略并制备了一个由氧化石墨烯与氟离子化学反应型分子荧光探针FC-A自组装的新型荧光纳米复合探针GO/FC-A。氧化石墨烯的催化性能使探针分子FC-A反应生成荧光染料IC-B的转化率提高，同时使更多的分析对象氟离子参与到反应中，并加速了这一反应进程，从而使GO/FC-A的灵敏度相较于FC-A升高了两倍以上，反应动力学速率提高了五倍而相应的响应时间从4小时以上缩短到30分钟左右，并且对氟离子的动态响应浓度范围从0-900μM拉宽到0-5mM。GO/FC-A的良好响应性能使其被成功应用于实际水样中氟离子的准确快速检测。而氧化石墨烯的生物相容性和载体功能还使GO/FC-A比FC-A具有更好的细胞内氟离子成像能力（第3章）。（二）细胞器内组分和分析对象双重控制激活亚细胞区域定位荧光分子探针研究与应用。设计能够提供亚细胞层面生物分子信息的研究工具具有重要的意义。目前亚细胞区域定位探针的常规策略是将靶向特定细胞器的导向基团修饰在探针分子上。但是导向基团的靶向能力并非尽善尽美，而分析对象又是非特异性地分布在细胞内不同部位，因而传统亚细胞区域定位探针存在空间分辨率不高和假信号干扰等缺点。为解决这一问题，我们提出利用细胞器内特有组分与分析对象双重控制激活区域定位荧光分子探针的应对策略。我们以溶酶体内气体信号分子硫化氢为研究对象，利用溶酶体异于细胞内其他组成部位的酸性特征，在结构可调的荧光团罗丹明衍生物上同时设计氢质子和硫化氢的专一性识别位点和溶酶体靶向基团以构建溶酶体定位的双控荧光分子探针SulpHensor。该探针只有在酸性条件和硫化氢同时存在情况下才能产生荧光信号，从而实现了酸性溶酶体内硫化氢变化的灵敏选择性示踪并能有效排除细胞内中碱性环境区域的假信号（第4章）。（三）荧光共振能量转移原理调控双光子荧光探针研究与应用。(1)针对目前基于芳基叠氮还原反应设计的硫化氢双光子荧光探针存在的易受光解，响应时间较长和响应机理易受环境影响等问题，我们利用荧光共振能量转移原理设计了以双光子荧光团苯并吡喃染料和兼具能量受体和分子识别单元功能的硝基苯并呋喃两者通过桥连基团哌嗪融合杂交形成的新型硫化氢双光子荧光分子探针TP-NBD。与之前报道的基于PET和ICT机理设计的硫化氢荧光分子探针相比较，这个FRET型荧光分子探针的稳定性，响应速率和灵敏度都得到了有效改进。利用这个新设计的双光子荧光分子探针，我们实现了血清样品中硫化氢的准确检测和细胞内硫化氢变化的成像分析以及活体斑马鱼样内硫化氢的深层组织成像（第5章）。(2)尽管基于共振能量转移原理的氧化石墨烯类荧光纳米传感体系最近发展迅速，但是处于紫外可见短波长区域的常规荧光标记染料限制了其在复杂样品和生物活体组织中的进一步应用。针对这一问题，我们提出利用性能良好的双光子染料代替单光子荧光染料构建新型双光子核酸适配体/氧化石墨烯自组装荧光纳米传感平台的改进办法。作为验证实例，我们将双光子染料苯并吡喃标记在三磷酸腺苷的核酸适配体上并与氧化石墨烯自组装形成一种新型双光子荧光纳米复合探针GO/Aptamer-TPdye，由于新型荧光纳米复合探针利用双光子染料作为信号报告单元，可以有效地避免实际样品检测时样品本身的自发荧光及自吸收现象，也可以减少对样品的光损伤，提高空间分辨率和增加穿透深度等，从而适用于复杂样品的检测和生物活体组织的深层次成像分析。因此应用GO/Aptamer-TPdye实现了复杂介质中、细胞和斑马鱼三磷酸腺苷的高选择性和高灵敏检测与成像分析（第6章）。