盾壳霉产抗细菌物质相关基因的克隆及抗细菌物质生态学功能的研究

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盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotirium)的重要寄生真菌,在世界范围内广泛存在,是菌核病的一种重要生防菌。本文以水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)为指示菌,对盾壳霉ZS-1菌株的T-DNA标记插入突变体库,进行了产抗细菌物质(ABS,Antibacterial substances)缺陷型突变体的筛选,以突变体ZS-1T12003为材料克隆到产抗生素相关的基因,并以该突变体为材料,对盾壳霉产生的ABS的生态学功能进行了研究,结果如下:从盾壳霉ZS-1菌株T-DNA标记插入突变体库中筛选出的产ABS缺陷型突变体ZS-1T12003、ZS-1T24630及ZS-1T25680。ZS-1T12003产孢正常,生长速度及寄生致腐核盘菌菌核的能力与出发菌株ZS-1无显著性差异(P<0.05),在PDA培养基上不产生抗真菌物质;ZS-1T25680不产孢,生长速度及寄生致腐核盘菌菌核的能力与ZS-1存在显著性差异(P<0.05),在PDA培养基上产生少量的抗真菌物质;ZS-1T24630仅产少量的孢子,生长速度及寄生致腐核盘菌菌核的能力与ZS-1存在显著性差异(P<0.05),在PDA培养基上不产生抗真菌物质。Southern杂交证实T-DNA标记在突变体ZS-1T12003中为单拷贝插入;以ZS-1T12003为材料,采用TAIL-PCR和RT-PCR技术对T-DNA标记插入位点的基因组DNA进行了克隆,获得了大小为1336bp的DNA片段:对该基因组DNA片段进行了序列分析,并利用GenScan软件进行了阅读框(ORF)预测:位于第77nt开始的ATG为起始密码子,该DNA片段中含有一个完整的阅读框:起始外显子(77-328nt);中间外显子(454-588nt);末端外显子(640-924nt),编码223aa。对推定的氨基酸序列进行功能预测,发现该序列中含有一保守的区域,即MADS-box域,故命名该基因为CMMADS-box1。CMMADS-box1与其它真菌的MADS-box具有高度的同源性,如与大孢粪壳霉菌(Sordaria macrospora)的MADS-box相同部位等同的氨基酸为67%,类似的氨基酸达74%:T-DNA标记破坏该基因的启动子。Southern杂交证实CMMADS-box1基因在菌株ZS-1的基因组中为单拷贝;RT-PCR结果表明CMMADS-box1基因在ZS-1T12003基因组中不表达,在菌株ZS-1的基因组中表达。构建了CMMADS-box1基因敲除载体,利用农杆菌介导转化的方法,获得了CMMADS-box1敲除转化子03GDT02,该转化子对水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)不具有拮抗活性,与ZS-1T12003表现出了相同的产ABS缺陷这一性状;03GDT02、ZS-1及ZS-IT12003三菌株的菌落形态无显著差别,在PDA培养基上均不产生抗真菌物质。为了研究盾壳霉产生的ABS的生态学作用,并排除T-DNA标记插入的影响,从突变体库中筛选到了一个突变体ZS-1T21559,其菌落形态、产ABS的能力、生长速度及寄生致腐核盘菌菌核的能力与出发菌株ZS-1没有显著性差异(P<0.05);出发菌株ZS-1、突变体ZS-1T12003、ZS-1T21559的生长速度和产孢能力不存在显著性差异(P<0.05);在PDA培养基上与核盘菌菌株Ep-1PNAa对峙培养过程中,未见抑菌圈的产生;无菌条件下及在自然土中寄生致腐核盘菌菌核的能力无显著性差异(P<0.05);ZS-1T12003与ZS-1T21559的孢子等量加入到放有菌核的自然土和灭菌土中的实验表明:随着培养时间的延长,ZS-1T12003每克菌核上的孢子量显著低于ZS-1T21559每克菌核上的孢子量(P<0.05),这说明:ZS-1T21559与ZS-1T12003相比,表现出成活和竞争的优势;出发菌株ZS-1和突变体ZS-1T12003、ZS-1T21559三菌株在被核盘菌侵染的油菜叶片上的定殖能力无显著性差异(P<0.05)。这些试验表明:盾壳霉突变体ZS-1T12003所缺失的ABS在盾壳霉的生存过程中,起到了一定的帮助其竞争的作用,但其所发挥的帮助盾壳霉竞争的作用对盾壳霉的生命活动不是至关重要的,只有在不适宜盾壳霉生长的条件下,这种帮助盾壳霉竞争的作用会表现的突出些。本文为理解抗生素在微生物生活中的作用提供一个实例,同时为研究盾壳霉产ABS的调控过程提供基因材料和思路。
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