背景与目的积极探索白血病新的治疗策略正日益受到关注白血病(leukemia)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。白血病细胞起源于造血干细胞,其细胞的生长特点是增殖失控、凋亡受阻及分化障碍。另外,白血病细胞充斥于人体的循环系统、造血器官及被侵犯的组织,这有别于实体瘤,其治疗方法受到很大的限制。因此,发掘能够抑制白血病细胞增殖、诱导白血病细胞凋亡、促进白血病细胞分化成熟的中药及其有效成分,并运用现代分子生物学技术探讨其作用机制已成为极具活力的重大课题之一。中药的抗肿瘤作用化疗药物的临床应用受到了毒副作用、耐药性等的限制。近年来,研究者们已经发掘出一些具有抗肿瘤活性的中药,且具有毒副作用较少、患者易于接受等优点。但是,中药抗肿瘤作用的机制仍是困扰研究者们的一个重大难题。黄芪多糖的活性成分、生物学活性和抗肿瘤作用黄芪为豆科植物属蒙古黄芪、膜荚黄芪的干燥根。黄芪的主要成分包括黄芪皂苷、黄芪多糖(Astragalus Polydsaccharide, APS)、氨基酸、微量元素和钙等。APS是黄芪的主要活性成分,是黄芪中含量最多、药理作用最强的一类物质。APS具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、抗应激、抗病毒、抗辐射、抗氧化等多种药理功效。值得注意的是,APS的抗肿瘤作用已被越来越多的研究证实；研究发现,APS在体内外对肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌和S180肉瘤等恶性肿瘤有明显的抑制作用。黄芪多糖的抗肿瘤作用机制及缺陷对于APS抗肿瘤作用的机制研究,主要集中在其增强机体免疫功能方面,如：APS能够促进白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-αmTNF-α)等细胞因子表达,能够增强树突状细胞(dendritic cell, DC)、巨噬细胞和自然杀伤细胞的吞噬能力。另外,研究还发现,APS能够通过影响端粒酶活性、血管生成等抑制肿瘤的生长。但是,运用现代分子生物学技术从分子水平探讨APS抗肿瘤作用机制仍需要深入研究。许杜娟等以小鼠实体型肿瘤模型和肝癌细胞株为研究对象的研究发现,黄芪总提取物明显抑制小鼠实体型肿瘤的生长,并可引起肝癌细胞系发生凋亡；而刘兵荣等研究却发现,黄芪多糖可能通过抑制核因子NF-κB表达来抑制大鼠脑出血后的细胞凋亡。提示APS与细胞凋亡的关系及相关机制值得进一步深入研究。研究内容、研究假设和目的意义本课题组成功提取了APS,拟在此基础上通过不同方法从不同角度进一步研究APS是否能够抑制人红白血病K562细胞增殖及其是否能诱导K562细胞凋亡。并进一步采用分子生物学技术探讨APS抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的分子机制。以期为APS用于白血病的治疗提供科学依据。方法1细胞株人红白血病K562细胞购自中科院上海细胞库。2APS对人红白血病K562细胞增殖的影响通过四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetra-zolium,MTT)法绘制生长曲线观察生长速度和倍增时间变化,通过流式细胞术检测细胞周期分布,以探讨APS是否能够抑制人红白血病K562细胞的增殖。3APS抑制K562细胞增殖的分子机制提取细胞总RNA和总蛋白并定量后,通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blotting等方法检测细胞周期蛋白A(CyclinA)、细胞周期蛋白B(CyclinB)、细胞周期蛋白E(CyclinE)和p21基因在mRNA和蛋白水平的表达。4APS对人红白血病K562细胞凋亡的影响通过Annexin V-FITC/PI结合流式细胞术、Caspase-3活性测定等方法研究APS是否能够诱导K562细胞凋亡。5APS诱导K562细胞凋亡的分子机制提取细胞总RNA和总蛋白并定量后,通过RT-PCR和Western blotting等方法检测B细胞淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、超大B细胞淋巴细胞瘤(B-cell lymphoma-extra large,Bc1-XL)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein, Bax)、凋亡抑制蛋白-1(inhibitor of apoptosis protein-1,IAP-1)和第二线粒体来源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondria-derived activatorof caspase, Smac)基因在mRNA和蛋白水平的表达。6统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(i±s)表示。两个样本均数的比较采用t检验。多个样本均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),方差齐时多重比较采用LSD方法检验,方差不齐时方差分析采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett’s T3方法检验。检验水准为=α0.05。结果1APS的提取和定量提取APS后,根据标准曲线计算出APS的浓度为49.340mg/mL。2APS对人红白血病K562细胞增殖的影响通过MTT比色法绘制细胞生长曲线并计算倍增时间,结果显示：与对照组K562细胞(0μg/mLAPS)相比,100μg/mL、200μg/mL和400μg/mLAPS处理的K562细胞生长速度均明显减慢(P<0.01),倍增时间显著延长(P<0.01),并且呈现浓度依赖性。从上述实验结果可以看出100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL的APS均能显著抑制K562细胞的生长速度并延长其倍增时间,结合实验中观察到的细胞状态,后续实验中均以200μg/mL的APS诱导48h的K562细胞为实验组,以不加药的K562细胞为对照组。流式细胞术检测周期分布结果显示：与对照组相比,实验组G1期细胞显著增多(P<0.01),而S期和G2/M期细胞显著减少(P<0.01)。3APS抑制K562细胞增殖的分子机制RT-PCR和Western blotting结果显示：与对照组相比,实验组K562细胞中cyclin B和cyclin E在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(P<0.01),而p21在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著增加(P<0.01),cyclin A在mRNA水平和蛋白水平的表达差异均无显著性(P>0.05)。4APS对人红白血病K562细胞凋亡的影响Annexin V-FITC/PI结合流式细胞术检测细胞凋亡结果显示：实验组K562细胞凋亡均数显著高于对照组K562细胞(P<0.01),对照组和实验组凋亡细胞百分比分别为：1.010%和32.966%。Caspase-3活性检测结果显示：与对照组相比,实验组K562细胞中Caspase-3活性显著增加(P<0.01)。5APS抑制K562细胞凋亡的分子机制RT-PCR和Western blotting结果显示：与对照组相比,实验组K562细胞中Bcl-2和IAP-1在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(P<0.01),而Bax和Smac在mRNA水平和蛋白水平表达均显著增加(P<0.01),Bcl-XL在mRNA水平和蛋白水平的表达差异均无显著性(P>0.05)。结论1证实了APS能够显著抑制人红白血病K562细胞的增殖能力。2首次证实了APS可能是通过下调Cyclin B和Cyclin E以及上调p21的表达而抑制K562细胞的增殖能力,其该作用可能与Cyclin A没有明显关系。3证实了APS能够诱导人红白血病K562细胞发生凋亡。4首次证实了APS可能是通过下调Bcl-2和IAP-1以及上调Bax和Smac的表达而诱导K562细胞发生凋亡,其该作用可能与Bc1-XL没有明显关系。