槲皮素抑制人胃癌BGC-823细胞增殖并诱导其凋亡的研究

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目的:将槲皮素(Quercetin,QUT)作用于人胃癌细胞株 BGC-823,设置不同的作用浓度和作用时间,观察细胞形态、增殖能力、细胞周期、凋亡作用、关键基因表达等指标的变化,研究槲皮素对胃癌细胞增殖、凋亡的作用,探讨其作用机制,为槲皮素用于临床防治胃癌提供可靠的理论基础和实验依据。  方法:将不同浓度的槲皮素与 BGC-823细胞体外共培养不同时间后:①倒置显微镜、细胞爬片HE染色分别观察细胞形态学变化;②四甲基噻唑氮蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法检测细胞生长抑制率;③流式细胞仪(flow cytometer, FCM)检测细胞周期、凋亡率;④透射电镜(electronic microscopy, EM)观察细胞超微结构变化及凋亡形态变化;⑤Western blot法检测Caspase-3蛋白以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达;⑥免疫组化染色法检测Caspase-3、bcl-2、Bax等蛋白的表达。  结果:①倒置显微镜下,对照组细胞贴壁生长,呈单层鹅卵石样紧密排列,形态不规则,有较长的伪足,可融合成集落,细胞分裂增殖旺盛,有多量瘤巨细胞;实验组经槲皮素处理后,细胞伪足回缩,细胞变小、变圆,细胞排列杂乱,或松散或聚集成团,出现悬浮现象,瘤巨细胞减少或不见瘤巨细胞,且存在时间和剂量依赖性。②细胞爬片HE染色,可见正常细胞为多边形,伪足较长,并有多量瘤巨细胞。经槲皮素处理后,细胞伪足回缩,细胞变小、变圆,瘤巨细胞减少或不见瘤巨细胞,存在剂量依赖性。③MTT法结果显示,槲皮素对胃癌BGC-823细胞有明显的增殖抑制作用,与对照组有显著性差异(P<0.05),随着作用时间的延长、作用剂量的增大,抑制作用越明显。④FCM检测可见槲皮素影响BGC-823细胞的细胞周期分布,使S期比例增高,G0/G1期比例降低,具有剂量和时间依赖性,各组之间差异具有显著性(P<0.05),FCM检测在G0/G1期前出现亚二倍体峰,即凋亡峰,该峰面积与槲皮素作用呈剂量和时间依赖性。同时,FCM检测显示随着槲皮素作用浓度的增大和作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐增加,各组之间差异具有显著性(P<0.05)。⑤透射电镜下正常BGC-823细胞体积较大,结构完整,核仁、核膜清晰,染色质分布均匀;60μmol/L、90μmol/L槲皮素作用24h后, BGC-823细胞出现凋亡特征,可见细胞皱缩、核质比例减小,核仁不清晰,核染色质集中在核膜下,有的细胞形成新月体样结构,并可见凋亡小体。⑥Western blot法检测结果显示:Caspase-3蛋白在不同浓度槲皮素作用下其17KD活性片段的比值分别为16.87%、26.14%、33.01%、67.36%、83.52%、99.22%,随着槲皮素浓度的增加,Caspase-3蛋白被大量活化,增强其表达,Bax阳性表达逐渐增强,bcl-2阳性表达逐渐减弱。⑦免疫组化染色法显示,随着槲皮素浓度的增大, BGC-823细胞的Caspase-3、Bax阳性表达逐渐增强,bcl-2阳性表达率逐渐降低,各组之间差异均具有显著性(P<0.05)。  结论:  1.槲皮素可导致胃癌细胞BGC-823形态发生改变。  2.槲皮素抑制胃癌细胞 BGC-823的生长和增殖,通过改变胃癌细胞 BGC-823的细胞周期分布,使细胞阻滞在 S期,从而抑制胃癌细胞 BGC-823的生长和增殖,且存在剂量和时间依赖性。  3.槲皮素可诱导胃癌 BGC-823细胞凋亡,通过降低 bcl-2/Bax比值,上调Caspase-3蛋白的表达来实现的,也存在着剂量-时间效应关系。
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