金荞麦的提取分离及其抗HBV活性研究

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本论文选取了具有防治肝炎或清热解毒作用的33种中草药,用重组的含有乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)基因组的人肝癌细胞HepG22.2.15为体外筛选模型,以药物对HepG22.2.15细胞合成、分泌HBeAg和HBsAg抗原的抑制作用作为筛选指标,进行了抗HBV活性初筛。结果发现所选取的33种中草药中有7种存在抗HBV活性,其中金荞麦的活性最强。选定金荞麦为进一步的研究对象,筛选抗HBV作用的活性部位,为从金荞麦中分离出抗HBV有效成分或单体化合物的研究与开发奠定基础,具体研究内容如下:  1)金荞麦、石花、骆驼刺、槟榔等33种中草药粉碎,60%乙醇热回流提取,减压回收溶剂,得到60%乙醇浸膏。  2)HepG22.2.15细胞分泌HBeAg和HBsAg规律的监测,结果显示,HepG22.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌量在第8天达到最高值。  3)以HepG22.2.15细胞为模型对金荞麦、石花等33种中草药进行体外抗HBV活性初步筛选。结果显示,金荞麦、石花、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草、槟榔7种中草药的60%乙醇提取物具有较好的体外抗HBV活性。  4)选取活性较显著的金荞麦、石花、佛甲草、石榴皮及槟榔为实验对象,在相同浓度梯度(10、20、40μg/mL)下比较这五种中草药对HepG22.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响。结果显示,金荞麦对HepG22.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用明显高于槟榔、石榴皮、石花、佛甲草,其抑制率均达到50%以上。  5)将金荞麦60%乙醇总提取物A的水溶液,经AB-8型大孔吸附树脂吸附、洗脱等分离手段,最终得到B、C、D、E4个部位。对分离的B、C、D、E部位进行体外抗HBV活性筛选,结果表明,D部位能够显著抑制HepG22.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg,在最大无毒的给药浓度40μg/mL下,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为54.8%和53.1%。  6)确定有效部位D后,经硅胶柱层析分离、氯仿-甲醇洗脱得8个部位:D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7和甲醇部位,经体外活性检测发现D7有较好的抗HBV作用,无毒浓度下,D7对HBsAg和HBeAg的抑制率分别是52.7%和59.7%。  7)利用反相液相色谱C18柱对D7部位进行分离,得两个组分F、G。:体外活性检测结果表明,在最大无毒浓度下,G对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为52.6%和72.3%;阳性对照物苦参素注射液对HBsAg、HBeAg抑制率分别为20.8%和48.5%,G对2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌抑制作用强于阳性药物,两者具有显著性差异。  本文经过对33种中草药抗HBV活性的筛选,发现金荞麦提取物具有很强的抗HBV活性,经硅胶柱层析和HPLC分离纯化后,与粗提物相比对HBeAg的抑制率提高约20%,说明分离纯化后金荞麦抗HBV活性部位得到富集;活性实验显示金荞麦提取物对HBsAg和HBeAg的抑制率随浓度的增加呈上升趋势,说明金荞麦中含有抗HBV活性的有效成分,具有开发成抗HBV药物的潜力。
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