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Pax6是眼发育过程中最重要的调控基因之一。从果蝇到人类等大量物种的眼发育和晶状体决定过程中都存在Pax6。Pax6可以形成多种蛋白亚型,如Pax6、Pax6APD和Pax6(5a)等。已有研究表明Pax6调控作用的多样性是由Pax6蛋白不同亚型控制的。本课题通过建立花背蟾蜍晶状体不同发育时期的实验模型,以鳃血循环期的胚胎为材料,采用RACE(Rapid Ampliphication of cDNA Ends)的方法,成功克隆得到花背蟾蜍Pax6 variant新基因(Genebank:FJ175151)。将该基因进行生物信息学分析,包括载体片段去除、基因开放可读框(Open ReadingFrame,ORF)预测、基因编码蛋白结构域预测、同源性的分析等。与花背蟾蜍Pax6进行比对,发现二者的差异在PST域3端,相似性为53.1％。PST域结构的改变可能导致反式激活功能的改变。配对盒基元序列和同源异型域这两个主要功能区高度保守性意味着该基因在基础发育过程中的重要作用。
通过RT-PCR方法获得花背蟾蜍Pax6和Pax6 variant差异部分基因序列,将其克隆到pMD-18T载体上,测序正确后将其克隆至pGEX-4T-3融合表达载体上构建了重组质粒pGEX-Pax6和pGEX-Pax6 variant。经测序后正确的重组子转化入Rosetta(DE3)表达宿主菌中,诱导表达GST-Pax6和GST-Pax6 variant融合蛋白。经GST亲和柱层析进一步纯化获得了可溶性重组蛋白。以纯化的融合蛋白GST-Pax6和GST-Pax6 variant分别作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western Blot检测其抗血清的效价、灵敏度和特异性。结果表明,Pax6和Pax6 variant血清效价均达到1:100000以上。应用Western Blot初步验证了转录因子Pax6从鳃血循环期到鳃盖完全封闭期都有表达,而Pax6 variant仅在鳃血循环期表达,表明Pax6在花背蟾蜍晶状体发育过程中起了更为重要的作用。Pax6 variant蛋白是一种Pax6截短蛋白,PST域3端的因短缺而失去反式激活功能。其DNA结合域与Pax6蛋白一样,可与Pax6蛋白竞争,从而减弱甚至阻断Pax6蛋白执行功能。所以Pax6 variant可能作为正常Pax6蛋白的竞争抑制物,起显性抑制作用。
以上的研究结果为深入探讨Pax6 variant基因和Pax6 variant融合蛋白在两栖类晶状体发育过程中的作用机理奠定良好的基础,为今后研究Pax6蛋白不同亚型的功能提供依据。