Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5（type Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5）是一种糖基化的跨膜蛋白,糖基化位点位于39K及84A,结构主要包括两个纤连蛋白结构域、一个信号肽和一个插入细胞膜的疏水C末端结构域。在蛋白水解酶的作用下裂解并释放多肽片段鸢尾素（irisin）。FNDC5/irisin最初在肌肉组织中被发现,认为可以促进白色脂肪转化为棕色脂肪,具有提高机体能量消耗和改善代谢疾病的作用,在代谢性疾病发病机制中起重要作用。FNDC5/irisin通过激活信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）逆转血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）表型转化,但目前FNDC5/irisin在VSMCs炎症、氧化应激和迁移中的作用与机制仍未见报道。本论文分成两个部分,分别研究了（1）FNDC5在高血压中对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3）炎性小体激活和氧化应激的作用及分子机制;（2）MiR-31-5p在调控FNDC5表达和对VSMCs迁移、氧化应激的作用及分子机制。一、FNDC5抑制血管平滑肌细胞NLRP3炎性小体激活和氧化应激的作用及分子机制1.背景高血压是一种常见的以持续性血压升高为基本特征的慢性心脑血管疾病。长期的慢性炎症和过高的氧化应激水平在高血压的发生发展过程中起到了关键作用,因此抑制血管炎症和氧化应激可能成为降低血压的治疗手段。VSMCs是血管中膜的主要细胞组成成分,VSMCs的功能异常在高血压、动脉粥样硬化、冠心病和动脉瘤等心血管疾病的病程中起重要作用。细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平是氧化应激水平的灵敏感受器,过度的氧化产物会导致炎症水平上升从而促进VSMCs的异常增殖、迁移、凋亡和细胞外基质沉积最终导致血管重构。然而在VSMCs中,FNDC5对NLRP3炎性小体激活和氧化应激的作用和机制未见报道。2.目的本研究拟探讨在血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）处理的VSMCs中,外源性FNDC5对NLRP3炎性小体激活和氧化应激的作用及分子机制,并探讨皮下埋泵微量缓释Ang Ⅱ对FNDC5^-/-小鼠（以C57BL/6J小鼠为背景进行FNDC5基因敲除）胸主动脉炎症和氧化应激的作用。3.方法实验采用含10%FBS、100 units/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞系（A7R5）。小鼠原代VSMCs培养在原代VSMCs专用培养基中,培养基含有10%细胞生长因子、10%FBS和1%双抗,并保持在37oC、5%CO₂的细胞培养箱中。本实验的动物购买自南京医科大学动物实验中心,采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠及FNDC5^-/-小鼠。在小鼠适应环境一周后,随机分为四组,每组各6只,正常对照组皮下埋入含有PBS的微量注射泵、正常实验组皮下埋入含有等量Ang Ⅱ的微量注射泵、FNDC5^-/-对照组皮下埋入含有PBS的微量注射泵、FNDC5^-/-实验组皮下埋入含有等量Ang Ⅱ的微量注射泵。期间监测小鼠血压、心率。两周后对四组小鼠进行麻醉、取材并进行急性实验。蛋白质免疫分析技术（Western blotting）检测NLRP3、FNDC5、沉默信息因子2相关酶1（Silent mating type information regulation 2 homologl,SIRT1）、含CARD结构域的凋亡相关斑点蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2,NOX2）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）、p-AMPK、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）前体及成熟体、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）前体及成熟体、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4,NOX4）和β-actin的蛋白表达水平。采用实时定量聚合酶链式反应（real-time PCR,RT-PCR）法检测FNDC5m RNA水平。酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测SIRT1酶活性水平。采用马松染色（Masson’s trichrome staining）检测小鼠胸主动脉血管腔纤维化和狭窄程度。Dihydroethidium（DHE）染色法检测小鼠原代VSMCs和A7R5细胞中活性氧水平。免疫荧光技术检测A7R5细胞中NLRP3的表达量。4.结果（1）FNDC5基因敲除加重Ang Ⅱ诱导的高血压和血管重构:在皮下植入渗透泵缓释Ang Ⅱ两周引起的高血压小鼠模型中,与WT小鼠相比,FNDC5基因敲除小鼠血压升高的更加显著,且小鼠胸主动脉中膜厚度和面积增加的更加严重。同时给予Ang Ⅱ两周,抑制了WT小鼠胸主动脉FNDC5的表达。（2）FNDC5基因敲除加重Ang Ⅱ诱导的血管氧化应激和NLRP3炎性小体激活:皮下植入渗透泵缓释Ang Ⅱ两周后,在WT和FNDC5^-/-小鼠胸主动脉中膜内,ROS的生成,NOX2、NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表达均升高,而与WT小鼠相比,这一效应在FNDC5^-/-小鼠中更加显著。（3）在Ang Ⅱ处理的A7R5细胞中,外源性FNDC5抑制Ang Ⅱ引起的氧化应激:Ang Ⅱ处理24 h增加了NOX2、NOX4的蛋白表达和ROS生成,外源性FNDC5的加入则抑制了Ang Ⅱ引起的这些效应。然而有趣的是,Ang Ⅱ处理24 h后,对A7R5细胞FNDC5的表达却无显著影响。（4）在A7R5细胞中,外源性FNDC5抑制Ang Ⅱ引起的NLRP3炎性小体激活:Ang Ⅱ处理24 h后,增加了NLRP3、ASC、procaspase-1、Caspase-1和pro-IL-1β的蛋白表达,并促进IL-1β生成。而外源性FNDC5的加入则抑制了Ang Ⅱ引起的NLRP3、Caspase-1的蛋白表达上调和IL-1β的生成。（5）FNDC5抑制氧化应激和NLRP3炎性小体激活的效应可被AMPK抑制剂阻断:在Ang Ⅱ处理的A7R5细胞中,外源性FNDC5通过促进AMPKα磷酸化抑制Ang Ⅱ诱导的ROS产生,NOX2、NLRP3的蛋白表达上调和IL-1β的生成,而这一作用可被AMPK的抑制剂Compound C阻断。（6）SIRT1抑制剂阻断FNDC5对氧化应激和NLRP3炎性小体激活的抑制效应:在A7R5细胞中,外源性FNDC5对Ang Ⅱ诱导的ROS产生和IL-1β的生成,NOX2、NLRP3蛋白表达上调的抑制作用被SIRT1抑制剂EX527阻断。（7）整合素蛋白受体抑制剂阻断FNDC5对氧化应激和NLRP3炎性小体激活的抑制作用:在Ang Ⅱ处理的A7R5细胞中,外源性FNDC5对Ang Ⅱ诱导的ROS产生和IL-1β的生成,NOX2、NLRP3蛋白表达上调的抑制作用被整合素蛋白受体抑制剂GLPG0187阻断,此外,FNDC5对AMPKα磷酸化,SIRT1活性和蛋白表达的促进作用亦被整合素蛋白受体抑制剂GLPG0187抑制。（8）在Ang Ⅱ处理的小鼠原代VSMCs中,外源性FNDC5抑制Ang Ⅱ诱导的氧化应激和NLRP3炎性小体激活:Ang Ⅱ（100 n M）处理小鼠原代VSMCs24 h,对小鼠原代VSMCs中FNDC5 m RNA和蛋白表达均无显著影响。外源性FNDC5抑制Ang Ⅱ诱导的ROS产生,NOX2、NLRP3蛋白表达上调以及IL-1β的生成,。同时Ang Ⅱ对AMPKα磷酸化、SIRT1活性和蛋白表达的抑制作用亦被外源性FNDC5所消除。5.结论FNDC5基因敲除加重Ang Ⅱ诱导的NLRP3炎性小体激活和氧化应激。外源性FNDC5通过激活整合素蛋白受体介导的AMPK磷酸化和SIRT1酶活性升高抑制Ang Ⅱ诱导的NLRP3炎性小体激活和氧化应激。二、MiR-31-5p通过抑制FNDC5表达促进血管平滑肌细胞迁移和氧化应激的作用及分子机制1.背景高血压是影响全球死亡率的一个重要因素,影响了全球25%以上的人口。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）在高血压的病程中和高血压所引发的终末器官损害中发挥着至关重要的作用。Ang Ⅱ是强有力的血管收缩剂,Ang Ⅱ直接诱导的血管收缩和VSMCs的过度增殖、迁移、炎症和氧化应激与高血压密切相关。Micro RNA（miRNA）是一类内源性的非编码小RNA,通过与靶基因m RNA的3’UTR区域结合抑制其转录水平。研究表明在大肠癌组织中,miR-31-5p通过抑制膜相关蛋白的表达促进大肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。但目前FNDC5在Ang Ⅱ诱导的VSMCs迁移和氧化应激中的作用以及miR-31-5p对FNDC5表达的调控仍不明确。2.目的本实验旨在探讨miR-31-5p在调控FNDC5表达和VSMCs迁移、氧化应激中的作用及分子机制。3.方法实验采用南京医科大学实验动物中心的8周龄雄性C57/BL6J（WT）小鼠和FNDC5^-/-小鼠,北京维通利华实验动物技术有限公司的8周龄雄性自发性高血压大鼠（Spontaneously hypertensive rat,SHR）和Wistar-Kyoto（WKY）大鼠。采用酶消化法提取SHR和WKY大鼠原代VSMCs及Male wild-type（WT）和FNDC5^-/-小鼠原代VSMCs,并将小鼠原代VSMCs、大鼠原代VSMCs和A7R5细胞培养在37oC、5%CO₂的细胞培养箱中。Western Blot检测NOX2和NOX4蛋白表达水平。RT-PCR检测FNDC5和miR-31-5p水平。DHE染色法检测VSMCs活性氧水平。采用Boyden小室实验和伤口愈合实验检测VSMCs的迁移能力。双荧光素酶报告基因实验检测FNDC5与miR-31-5p的结合情况。4.结果（1）MiR-31-5p促进大鼠原代VSMCs迁移:MiR-31-5p模拟剂促进SHR和WKY大鼠原代VSMCs迁移,并且这一效应在SHR原代VSMCs中更加显著。而miR-31-5p抑制剂仅抑制SHR原代VSMCs迁移,对WKY大鼠原代VSMCs迁移无显著影响。（2）MiR-31-5p抑制FNDC5的表达:MiR-31-5p模拟剂抑制野生型（WT-FNDC5）质粒的荧光素酶分子活性,但在突变的（Mut-FNDC5）质粒中没有抑制效果;在SHR原代VSMCs中miR-31-5p表达量远高于WKY大鼠VSMCs;miR-31-5p模拟剂同时抑制WKY和SHR原代VSMCs中FNDC5的表达;并且在A7R5细胞中,miR-31-5p模拟剂同样也抑制了FNDC5的表达。（3）外源性FNDC5抑制SHR原代VSMCs迁移:在培养的大鼠原代VSMCs上清中加入外源性FNDC5,外源性FNDC5的加入抑制了SHR原代VSMCs迁移但对WKY大鼠原代VSMCs迁移无显著抑制效果。（4）FNDC5基因敲除促进小鼠原代VSMCs迁移:Ang Ⅱ（100 nmol/L）处理小鼠原代VSMCs 24小时构建细胞迁移体外模型。与WT小鼠原代VSMCs相比,Ang Ⅱ诱导的促细胞迁移作用在FNDC5^-/-小鼠原代VSMCs中表现的更加显著。（5）外源性FNDC5抑制SHR原代VSMCs氧化应激:SHR原代VSMCs中ROS的产生,NOX2和NOX4的蛋白表达均高于WKY大鼠原代VSMCs,而外源性FNDC5的加入则显著抑制SHR原代VSMCs中ROS的产生,NOX2蛋白表达,但对WKY和SHR原代VSMCs中NOX4蛋白表达均无显著影响。（6）FNDC5基因敲除加重小鼠原代VSMCs氧化应激:PBS处理后,WT小鼠或FNDC5^-/-小鼠VSMCs中ROS的产生,NOX2、NOX4的蛋白表达均不升高。Ang Ⅱ处理则显著升高小鼠VSMCs中ROS的产生,NOX2的蛋白表达,并且这一效应在FNDC5^-/-小鼠中更加显著。但Ang Ⅱ处理对WT和FNDC5^-/-小鼠VSMCs中NOX4的表达均无显著影响。（7）MiR-31-5p抑制剂抑制SHR原代VSMCs氧化应激:MiR-31-5p抑制剂对WKY大鼠VSMCs中ROS产生,NOX2的蛋白表达没有影响,但显著抑制SHR原代VSMCs中ROS产生,NOX2的蛋白表达,且对WKY和SHR原代VSMCs中NOX4的表达均无显著影响。（8）外源性FNDC5抑制miR-31-5p模拟剂诱导的氧化应激增强:MiR-31-5p模拟剂、MiR-31-5p模拟剂+外源性FNDC5对WKY大鼠VSMCs中ROS产生,NOX2的蛋白表达均无显著影响。而在SHR原代VSMCs中,miR-31-5p模拟剂显著增加ROS产生,NOX2的蛋白表达,而外源性FNDC5的加入则抑制了这一现象。但是miR-31-5p模拟剂、miR-31-5p模拟剂+FNDC5对WKY和SHR原代VSMCs中NOX4的蛋白表达均无显著影响。5.结论MiR-31-5p通过抑制FNDC5的表达加重SHR原代VSMCs迁移和氧化应激。外源性FNDC5抑制SHR原代VSMCs迁移和氧化应激。FNDC5基因敲除加重Ang Ⅱ诱导的小鼠原代VSMCs迁移和氧化应激。