抗菌脂肽是由芽孢杆菌代谢产生的由脂肪烃链和氨基酸环构成的具有生物活性的多肽类物质,具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗支原体等作用,且安全无毒、易降解,在医药、食品、生防控制、石油开采、环境治理以及生物制药等领域引起人们广泛的关注,显示出广阔的市场开发价值。抗菌脂肽由一大类结构相似的多组分脂肽化合物组成,每种组分又有多种同系物,使得产物组分复杂,组分间分离有难度,给该类化合物的定量带来困难。目前,抗菌脂肽的定量方法主要采用称重、测表面张力和溶血活性及高效液相色谱等方法,这些方法难以准确定量,不能适应实际生产需求,需建立新的准确定量方法。此外,抗菌脂肽通常是利用合成培养基采用传统发酵生产,相对实际应用来说,其产量低,成本高,限制了进一步扩大生产应用,需要研究新的发酵方法,突破产量瓶颈。不同结构的抗菌脂肽具有各自独特的化学性质和生物活性,研究不同培养条件下不同组分的定向积累具有十分重要的意义。据此,本研究采用高效液相色谱-质谱联用仪(LC-MS),建立对抗菌脂肽组分Surfactin和Iturin的定量方法并分析不同发酵条件对抗菌脂肽组分及产量的影响,结合生物被膜发酵方法利用凹凸棒土等几种大表面积基质建立高密度纳豆菌发酵体系并分析几种类信号分子的添加对脂肽发酵体系的影响,旨在提高抗菌脂肽产量,建立新型发酵体系,实现抗菌脂肽特定组分的定向积累,为抗菌脂肽的生产应用提供依据。得到如下结果:1.利用LC-MS,对质谱条件、流动相、色谱柱、方法的选择性等进行优化,建立了芽孢杆菌发酵液中的抗菌脂肽定量测定方法:选择VenusilXBPCN柱,以7:3的5 mmol·L-1乙酸铵(0.1%甲酸)溶液-乙腈溶液为流动相,对抗菌脂肽进行洗脱分析。在优化条件下,抗菌脂肽在0.20～10.0μg·L-1的添加水平下的线性关系良好(R2≥0.9995),方法的加标回收率为93.3%～108.22%,精密度为4.14%～13.30%,检出限可达0.374mg·L-1。本方法定量准确,操作简便,克服了传统检测方法的不足,为抗菌脂肽中更多组分的定性定量检测以及其生产应用提供了切实依据。2.将凹凸棒、活性炭、纱布等几种大表面积基质加入纳豆菌培养液中培养,测定发酵液中脂肽的生成量,并通过扫描电镜从微观形态上观察菌体在大表面基质上的附着状况,初步分析大表面基质的作用机制,建立新的生物被膜发酵体系。结果表明,在相同的发酵条件下,凹凸棒实验组效果最佳,其产生的抗菌脂肽对金葡菌的最高抑菌率为63.24%,较对照组高23.62%,活性炭次之,较对照组高11.93%,纱布组效果较弱,较对照组高9.66%;凹凸棒实验组发酵液中的最大生物量为4.7×108,较对照组高44.73%,活性炭组较对照组高38.52%,纱布组较实验组高38.56%;扫描电镜观察到芽孢杆菌在凹凸棒表面形成的生物被膜组织致密,粘附稳定,附着有高密度的菌体;活性炭表面的生物被膜表现出特殊的褶皱结构,粘附有大量的被膜态菌体,纱布纤维表面形成相对较稀薄但完整连贯的生物被膜并有较多菌体粘附。三种大表面固体基质的加入对抗菌脂肽产量具有明显提增效果,其中凹凸棒的效果最好;产量提升的原因可能与大表面基质的加入增加了发酵液中的菌体浓度以及菌体在大表面固体基质上可以形成生物被膜有关。3.将类信号分子添加至纳豆芽孢杆菌发酵系统中,探讨其对抗菌脂肽发酵体系的影响。利用LC-MS法测定抗菌脂肽的含量,细菌菌落计数法测定不同发酵体系中的生物量,结果表明:六种类信号分子的添加对抗菌脂肽的发酵均具有促进作用,其中固态发酵甲醇提取物对抗菌脂肽的产量提升作用最为明显,Surfactin和Iturin标准品以及抗菌脂肽液态发酵甲醇提取物的添加对抗菌脂肽的发酵影响并不大;菌体在15%的添加比例时,对抗菌脂肽发酵的促进作用最为强烈,其他五种类信号分子在10%的添加比例时对抗菌脂肽发酵的促进效果最好;在试验条件下,随着发酵时间的延长,以24h为临界点,大部分类信号分子对抗菌脂肽产生的促进作用呈现先上升后下降的趋势;发酵液中菌体的浓度同类信号分子的添加量以及抗菌脂肽的产生量没有直接的相关性。类信号分子对抗菌脂肽发酵具有促进作用,具体的调控机制及量效关系值得进一步深入研究。4.利用LC-MS检测方法研究不同发酵条件对抗菌脂肽发酵的影响,分析不同的培养基、发酵温度、通气量等发酵条件对抗菌脂肽产量及组分的影响,结果表明:在实验条件下,采用Landy培养基在30℃条件下进行发酵,抗菌脂肽获得最佳产量;随着发酵摇床转速的提高,抗菌脂肽产量增加,并在实验可控范围200r·min-1时产量达到最大;不同的发酵方式会影响抗菌脂肽组分的比例:Landy培养基发酵的抗菌脂肽Iturin组分达到80.58%,明显高于其他培养基;随发酵温度的升高,Iturin组分呈现出先增后减的趋势,在28℃时,达到最大84.10%;随摇床转速的升高,抗菌脂肽中Iturin组分的含量升高,并在160r·min-1时达到最大81.78%;同液态发酵相比,固态发酵中Surfactin的组分比重显著增加,从24.25%增至53.72%,其中1008.20和1071.20组分比重变化比较显著。