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目的:14-3-3γ介导槲皮素对阿霉素诱导心肌毒性的保护作用的研究方法:1、原代新生大鼠心肌细胞培养所有实验方案均遵循美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南（NIH出版物No.85-23,1996年修订）,并经南昌大学伦理委员会批准（No.2015-0112）)。心肌细胞源自如前所述制备的2日龄Sprague Dawley大鼠。在D-Hanks平衡盐溶液中用胰酶消化心室,离心（5分钟,60g）后收获细胞,并在培养皿上预先铺涂1%明胶（37℃,30分钟）以除去成纤维细胞。18小时后,洗涤心肌细胞并在无血清维持培养基中培养一段时间后进行实验。2、实验分组实验组设计如下:（1）对照组:心肌细胞在正常条件下培养24小时;（2）阿霉素组:将心肌细胞暴露于1μM阿霉素24小时;（3）槲皮素+阿霉素组:在阿霉素暴露前用槲皮素（10,20,40,80μM）处理22小时的心肌细胞;（4）槲皮素+pAD/14-3-3γ-shRNA+阿霉素组:槲皮素处理前用pAD/14-3-3γ-shRNA处理2小时心肌细胞,再和槲皮素孵化22小时后暴露于阿霉素;（5）槲皮素+pAD/scr RNAi+阿霉素组:在槲皮素处理之前用pAD/scrRNAi处理2小时的心肌细胞,再和槲皮素共孵化22小时后暴露于阿霉素。3、腺病毒转染将pAD/14-3-3γ-shRNA或pAD/scrRNAi的重组质粒转染到心肌细胞中,转染效率大约为85%。4、MTS检测细胞存活率MTS比色试验用于研究暴露于阿霉素后心肌细胞的细胞存活率和生长的方法。MTS是浅黄色底物,能产生在与活细胞孵化时直接在培养基中解离的深蓝色结晶甲臜。通过微量板读数器在490nm处测量每个孔的吸光度,记录与培养中活细胞数成正比的吸光度,其结果以对照的百分比表示。5、乳酸脱氢酶（LDH）活性测定LDH是心肌细胞的细胞内酶,在细胞损伤过程中释放到培养基中。在实验处理后,我们收集上层液的LDH并根据LDH测定试剂盒检测LDH的活性。6、免疫印迹分析裂解收获的细胞,然后在凝胶装置中进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,随后转膜、封闭、上一抗、二抗,最后将聚偏二氟乙烯膜用增强的化学发光混合物饱和1分钟,并使用预制X射线胶片通过自体绘图观察300秒,使用Quantity One软件用光密度扫描分析条带。7、心肌细胞内活性氧ROS含量检测。2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）是膜可渗透的染料,并用于确定是否减少ROS产生。根据制造商提供的方案进行测定,DCFH-DA可通过细胞内酯酶转化为DCFH,然后将其氧化成高度荧光的2’,7’-二氯荧光素。并且使用流式细胞仪分别在485nm和528nm的激发和发射波长下测定每组的荧光强度。8、评估抗氧化酶的活性、非酶抗氧化剂和脂质过氧化氢酶的水平过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是体内重要的抗氧化酶,氧化（GSSG）和还原型（GSH）谷胱甘肽水平以及GSH/GSSG比率所反映的被认为是细胞健康的重要指标。根据制造商的说明收集细胞裂解的上清液;最后,通过酶标仪（Bio-rad 680,USA）测试所有收集物。9、心肌细胞凋亡线粒体膜电位（MMP）检测MMP的缺失是细胞凋亡的早期征兆。JC-1是一种亲脂性的阳离子染料,当MMP增加时,它可以选择性地进入线粒体并可逆地将颜色从绿色变为红色。通过流式细胞仪分别测量在530/580nm（红色）及485/530nm的（绿色）的激发和发射波长的荧光。细胞的红色与绿色荧光强度的比率反映了MMP的水平。10、线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放程度检测mPTP的开放在细胞凋亡中起主要作用。Ca2+诱导的线粒体肿胀测定用于确定mPTP的开放。使用线粒体/细胞溶质分馏试剂盒分离心肌细胞的线粒体,在520nm观察吸光度的变化,用于测量mPTP开放的程度。11、细胞凋亡蛋白酶-3的活性细胞凋亡蛋白酶家族被证明在介导各种细胞凋亡反应中发挥着重要作用。细胞凋亡蛋白酶-3作为催化剂将Ac-DEVD-рNA转化为pNA,其在405nm处显示出强吸收峰。因此,根据细胞凋亡蛋白酶-3活性测定试剂盒（BestBio,China）提供的方案可通过每个实验组吸光度分析细胞凋亡蛋白酶-3的活性。12、细胞凋亡程度评估通过膜联蛋白V-EGFP/PI凋亡检测试剂盒（KeyGENBioTECH,南京,中国）进行细胞凋亡的评估。采用流式细胞术（Becton-Dickinson,USA）分析染色细胞,检测细胞损伤指标DCF荧光。结果:1、槲皮素预处理组的细胞存活率以剂量依赖的方式高于阿霉素组（P<0.01）。在多变量实验中,槲皮素的最佳预处理浓度为20μM（P<0.01）。20μM槲皮素+pAD/14-3-3γ-shRNA+阿霉素组的细胞存活率低于槲皮素+阿霉素组和20μM槲皮素+pAD/scrRNA+阿霉素组（P<0.01）。2、槲皮素预处理组LDH活性以剂量依赖的方式低于阿霉素组（P<0.01）。20μM槲皮素+pAD/14-3-3γ-shRNA+阿霉素组的LDH活力远高于槲皮素+阿霉素组（P<0.01）。表明敲除14-3-3γ可减弱槲皮素对阿霉素诱导的心机损伤的保护作用。3、槲皮素预处理可上调心肌细胞中14-3-3γ的表达。在槲皮素+阿霉素组和槲皮素+pAD/scrRNAi+阿霉素组中,心肌细胞中14-3-3γ的表达比在阿霉素组高。然而,通过添加pAD/14-3-3γ-shRNA可抑制这些作用。表示槲皮素可以上调14-3-3γ的表达。4、槲皮素预处理减少心肌细胞中ROS的产生,抵抗阿霉素诱导的毒性。与对照组相比,阿霉素组的ROS水平的峰值显著向右移动,这表明阿霉素组的ROS产生明显增加（P<0.01）。与阿霉素组相比,槲皮素预处理导致ROS水平峰值向左移动,这表明ROS产生显著降低（P<0.01）。与槲皮素+阿霉素组相比,槲皮素+pAD/14-3-3γ-shRNA+阿霉素组心肌细胞中ROS的峰值向右移动,这表明ROS的产生显著高于槲皮素+阿霉素组（P<0.01）。5、槲皮素预处理保留了抗氧化酶的活性,非酶抗氧化剂的水平,并减少了心肌细胞中脂质过氧化,以对抗阿霉素诱导的毒性。与对照组相比,阿霉素组中SOD、GP-x和过氧化氢酶活性较低、MDA水平较高（P<0.01）。然而,槲皮素预处理显示出SOD,GP-x和过氧化氢酶活性显着增加,并且MDA水平降低（P<0.01）。但敲除14-3-3γ可以抵消槲皮素预处理对SOD、GP-x、CAT和MDA的影响（P<0.01）。与对照组相比,阿霉素导致GSH含量和GSH/GSSG比值显着降低（P<0.01）。槲皮素预处理在这些参数中显示出显著增加（P<0.01）,表明槲皮素可以通过增加非酶抗氧化剂的水平来逆转由于阿霉素诱导的毒性引起的氧化应激。6、槲皮素预处理抑制心肌细胞中MMP的丧失,与对照组相比,阿霉素组MMP水平的峰值显著向左移动,表明阿霉素组中MMP的丧失（P<0.01）。槲皮素预处理导致MMP峰值向右移动,表明显著阻止了阿霉素诱导的MMP的丧失（P<0.01）。与槲皮素+阿霉素组相比,阿霉素+pAD/14-3-3γ-shRNA+阿霉素组中MMP的峰值向左移动,这表明相比槲皮素+阿霉素组MMP明显丧失（P<0.01）。7、槲皮素预处理抑制心肌细胞中mPTP的开放,对抗阿霉素诱导的毒性。阿霉素组显示出最陡的下降趋势,其次是槲皮素+pAD/14-3-3γ-shRNA组（P<0.01）。槲皮素预处理阻止了吸光度的下降（P<0.01）。这些结果表明槲皮素降低了mPTP的开放性;添加pAD/14-3-3γ-shRNA组吸光度明显降低（p<0.01）。8、槲皮素预处理抑制心肌细胞中阿霉素诱导毒性的caspase-3活性。与对照组相比,阿霉素组caspase-3活性显著增加（P<0.01）,与阿霉素组相比,槲皮素预处理组显著抑制caspase-3活性（P<0.01）。槲皮素+pAD/14-3-3γ-shRNA组caspase-3活性再次升高（P<0.01）。添加pAD/14-3-3γ-shRNA可以抵消槲皮素预处理抑制caspase-3活性作用。9、槲皮素保护心肌细胞免受阿霉素诱导的细胞凋亡。与对照组比较,阿霉素组细胞凋亡率较高,差异有统计学意义（p<0.01）。与阿霉素组比较,槲皮素预处理组细胞凋亡率降低,（p<0.01）。然而,槲皮素+pAD/14-3-3shRNA+阿霉素组细胞凋亡率较槲皮素预处理组明显增加（p<0.01）。结论:1、槲皮素通过上调14-3-3γ表达,抑制氧化应激和改善线粒体功能保护心肌细胞免受阿霉素损伤。2、研究结果表明,14-3-3γ可能是具有显著保护心肌细胞免受阿霉素诱导的心脏毒性作用的新靶点。