目的:脓毒症(Sepsis)是由于病原体入侵等原因导致的宿主全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),发展到晚期出现脓毒症休克和多器官功能障碍综合征(multiple organs dysfunction syndrom,MODS),在过去几十年里发病率、病死率始终居高不下,严重威胁人类健康。虽然脓毒症的严重性早在希波拉底时期就已被认识,但直到今天对脓毒症的发病机制的探讨和治疗还没有根本性突破。众多学者认为脓毒症的发生机制是炎症失控,致使促炎介质过度释放,从而引起严重的组织损伤。巨噬细胞是机体固有免疫的重要细胞,是脓毒症发生炎症反应的一线细胞,与脓毒症过度炎症反应紧密相联。脓毒症的既往研究表明,巨噬细胞的早期炎症反应和革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)结构有关,LPS刺激的巨噬细胞发生炎症反应是经典的体外脓毒症模型。有研究表明Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)是主要的LPS识别受体。TLR4激活后通过一系列级联反应,最终使核因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)活化。新近研究表明,在此过程中鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinase,SPHK1)的活化和表达增加对NF-κB的激活亦发挥了重要的作用。NF-κB被激活后启动免疫和炎症相关基因的转录,引起众多基因的互相交叉表达,导致炎症过程升级。失控表达大量炎症因子如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),白介素-1(Interleukin-1,IL-1),白介素-6(Interleukin-6,IL-6),白介素-8(Interleukin-8,IL-8)及黏附分子等,参与脓毒症休克和多器官功能性衰竭的发生。其中,TNF-α和IL-6是巨噬细胞分泌的最主要的两种促炎细胞因子,其过度分泌可导致全身广泛的炎症和组织损伤,但促进其大量分泌的分子机制仍未完全阐明。因此,理论上有效阻断LPS信号转导通路,抑制炎症介质的产生,调节巨噬细胞的促炎症反应对治疗感染性炎症有重要意义。尽管近二十年来我们对脓毒症的发病机制和治疗策略方面的知识都有了长足的发展,但几乎所有的脓毒症临床试验包括近年来应用于临床的重组人活化蛋白C(Recombinant human activated protein C,rhAPC)均未能取得明显疗效。目前临床尚无有效的免疫调节药物。脓毒症对因治疗时抗菌药是必用的,我们设想可否选用兼顾有一定免疫调节作用的抗菌药在治疗中起到一举两得的效果,既针对病原菌进行治疗,又能减轻脓毒症的过度炎症反应,降低病死率。喹诺酮类(Quinolones,QNs)属化学合成的广谱抗菌药物,以其对G-和G+菌的双重杀菌活性在临床上广泛应用。近年来大量研究结果显示某些QNs尚有免疫调节活性。目前抗感染治疗不仅要考虑抗菌药对细菌的敏感性、抗菌强度,还应考虑抗菌药的体内药效与免疫调节作用的关系;同时,抗菌药的应用也不仅仅限于感染的治疗,还有可能发展到免疫系统疾病的治疗。因而,深入研究QNs类抗菌药的免疫调节作用将是今后研究的一个重要领域,将使抗菌药的临床应用变得更为合理、有效和广泛,具有十分重要的科学意义。莫西沙星(Moxifloxacin,MXF)为四代喹诺酮,具有强大的抗菌活性,而且研究显示其对免疫系统有激活与抑制的双向调节作用。近年研究发现MXF不仅影响人类和小鼠白细胞的某些细胞因子的产生,而且对LPS刺激下一些免疫细胞如成纤维细胞、单核细胞、内皮细胞等均有一定的免疫调节作用,但关于MXF是否参与LPS刺激的巨噬细胞炎症反应影响的研究还很少。因此我们选择MXF作用脓毒症的体外巨噬细胞模型,观察MXF是否可以影响LPS诱导的巨噬细胞的炎症因子分泌,同时观察其对LPS刺激通路上3个最重要的因子TLR4、SPHK1和NF-κB是否发挥重要作用,探讨MXF能否通过调节巨噬细胞的炎症反应,从而达到改善脓毒症预后的目标。本研究通过LPS处理小鼠腹腔巨噬细胞,建立离体脓毒症炎症反应模型,测定不同浓度和不同时间点巨噬细胞的TLR4、SPHK1的表达和活性、促炎因子水平及相关的细胞因子等的表达;验证不同浓度MXF对LPS处理后的巨噬细胞因子的影响,并确定最佳的影响浓度;通过小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术靶向沉默TLR4基因及Western blot、Real-time PCR和ELISA等技术,从细胞水平探讨MXF对巨噬细胞TLR4、SPHK1可能的影响及对促炎因子抑制的机制。研究方法:1.小鼠腹腔原代巨噬细胞培养。以终浓度为500ng/ml的LPS刺激,观察细胞形态学变化。免疫组化检测细胞TLR4、SPHK1、NF-κB蛋白的表达。Real-time PCR检测不同时间点细胞TLR4、SPHK1、NF-κBmRNA水平的表达。Western blot检测不同时间点细胞TLR4、SPHK1、NF-κB蛋白水平的表达。ELISA检测不同时间点细胞上清液TNF-α和IL-6,以得到LPS刺激后各指标升高的最佳时间点,进行下一步实验。2.不同浓度MXF对LPS刺激下小鼠腹腔巨噬细胞的影响。根据上步实验确定LPS刺激最佳时间点(即各指标变化最明显时对应时间点),据应用LPS、MXF处理的情况,将细胞分5组,收集LPS处理不同时间点各组细胞及细胞上清液。Real-time PCR和Western blot检测各组细胞TLR4、SPHK1、NF-κB mRNA和蛋白水平的表达。ELISA检测各组细胞上清液TNF-α、IL-6的分泌水平。免疫荧光检测LPS各组细胞TLR4、SPHK1、NF-κB p65的表达分布。确定MXF处理小鼠腹腔巨噬细胞的最佳作用浓度,记为γmg/L,用于进行后续实验。3.TLR4沉默对MXF及LPS处理下小鼠腹腔巨噬细胞的影响。(1)RNAi沉默小鼠腹腔巨噬细胞中TLR4基因(2)TLR4沉默及MXF作用LPS处理下小鼠腹腔巨噬细胞。Real-time PCR和Western blot检测各组细胞TLR4、SPHK1、NF-κB mRNA和蛋白水平的表达。ELISA检测各组细胞上清液TNF-α、IL-6的分泌水平。结果:1.LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞TLR4、SPHK1、NF-κB p65 mRNA及蛋白水平均明显高于control组(P<0.0001)。细胞TNF-α和IL-6分泌水平在24h升高最明显(P<0.0001)。2.一定浓度的MXF可抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TLR4、SPHK1、NF-κB p65 mRNA表达及TNF-α和IL-6分泌量的升高,尤其在MXF16mg/L的浓度下该抑制作用最强(P<0.0001)。免疫荧光亦证明MXF的这种抑制作用。3.与其他两对siRNA及NC组对比,第3对1567siRNA对TLR4基因的沉默效率最强。在小鼠腹腔巨噬细胞中TLR4基因沉默后,SPHK1、NF-κB p65蛋白表达水平减少(P<0.001)。MXF与TLR4 siRNA一起作用,可进一步降低SPHK1、NF-κB p65的表达(P<0.001)。细胞上清液中TNF-α和IL-6分泌亦减少(P<0.001)。结论:1.LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞后在不同时间点可见TLR4、SPHK1、NF-κB p65 mRNA表达和蛋白水平的增高,TNF-α和IL-6分泌增多,提示LPS通过TLR4、SPHK1、NF-κB p65参与了小鼠腹腔巨噬细胞的炎症反应。2.在一定浓度下MXF对LPS刺激下小鼠腹腔巨噬细胞的炎症反应有抑制作用,MXF可使巨噬细胞中TLR4、SPHK1、NF-κB p65的表达减少,进而抑制了巨噬细胞促炎因子的释放。这种抑制作用可能与TLR4、SPHK1蛋白表达减少有关,说明MXF可能通过TLR4、SPHK1影响巨噬细胞炎症反应。3.在小鼠腹腔巨噬细胞TLR4基因沉默后,SPHK1、NF-κB p65蛋白表达减少,细胞上清液中TNF-α和IL-6分泌亦减少。MXF可与TLR4 siRNA同用,进一步抑制巨噬细胞的炎症反应。