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第一部分:颅脑损伤大鼠亚低温治疗作用下CIRP表达的研究目的:亚低温疗法是现阶段重型颅脑损伤急性期重要的治疗措施之一,但亚低温对颅脑损伤患者神经保护作用调控机制尚未明确。研究显示CIRP可能是亚低温保护作用的温度依赖性关键调控蛋白,本次研究以CIRP为切入点,观察脑皮层、海马、下丘脑部位脑细胞凋亡与CIRP表达情况,在不同时间点,检测下丘脑脑组织内CIRP蛋白表达与ERK通路激活情况,从而讨论CIRP表达在颅脑损伤大鼠亚低温治疗过程中的作用机制。方法:将大鼠随机分为对照组(Group 1),空白AD5-GFP转染组(Group 2)及AD5-GFP-CIRP-Si RNA转染组(Group 3),每组再分为4个亚组分别为Sham组、TBI组、MH组及TBI+MH组。病毒转染Group 2,3组,检测病毒转染情况,造模后检测各组皮层、海马、下丘脑部位脑组织细胞凋亡情况,应用RT-PCR法检测三个部位脑组织CIRP m RNA表达情况,应用Western blot法检测下丘脑部位不同时间段CIRP、MEK、p-MEK、ERK-1/2、p-ERK-1/2蛋白表达情况。结果:病毒载体有效转染入Group2,3组对应部位脑组织内。细胞凋亡检测显示,亚低温治疗可显著减轻皮层、海马、下丘脑部位脑组织凋亡(p<0.05),其中抗凋亡作用在下丘脑部位较其他部位更加显著(p<0.05),经过CIRP静默表达后亚低温抗凋亡作用消失。RT-PCR法检测显示,亚低温治疗可以使皮层、海马、下丘脑部位CIRP表达升高(p<0.05),同时,下丘脑部位较皮层、海马区表达显著升高(p<0.05)。Western blot检测显示,亚低温治疗使下丘脑CIRP蛋白表达从6h开始显著升高(p<0.05),并于48 h达到高峰,于72 h呈下降趋势。MEK激活度检测显示,TBI、MH、TBI+MH三组MEK激活度均表现出进行性升高,并于24 h达到峰值,随后进行性下降,MEK激活程度与CIRP静默表达无相关性,说明CIRP蛋白表达对MEK激活无影响。ERK-1/2激活检测显示,亚低温治疗可导致ERK-1/2激活度峰值前移,并迅速降低其激活度,当CIRP静默表达时此作用消失。结论:在亚低温治疗颅脑损伤过程中,CIRP因低温作用而在皮层、海马、下丘脑部位过表达,其中下丘脑部位更加明显,CIRP作用机制可能通过直接调控ERK-1/2激活,使其激活度随时间推移迅速降低,减少对应部位脑组织细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。第二部分:参附注射液对颅脑损伤大鼠亚低温期CIRP表达的影响目的:从CIRP表达情况推测参附注射液辅助亚低温治疗颅脑损伤患者的作用机制。方法:将大鼠随机分为对照组(Group 1),空白AD5-GFP转染组(Group 2)及AD5-GFP-CIRP-Si RNA转染组(Group 3),再将Group 1,2,3各分为三个亚组,分别为创伤亚低温对照组(Control)、低剂量组(Low dose)、高剂量(High dose)药物治疗组,均首先给予颅脑损伤致伤及亚低温治疗造模,造模成功后进行分组处理。取大鼠脑皮层、海马、下丘脑部位脑组织,检测脑细胞凋亡、CIRP、MEK、ERK表达。结果:不同部位脑细胞凋亡检测显示,在Group 1,2中低剂量、高剂量组中皮层、海马、下丘脑部位细胞凋亡指数均较对照组显著降低(p<0.05),通过药物治疗显著降低这三个部位细胞凋亡,经CIRP静默表达后,各组凋亡指数差异无显著性(p>0.05),亚低温及药物对脑细胞凋亡抑制作用消失。RT-PCR检测显示,在Group1,2中低剂量组、高剂量组较对照组CIRP m RNA表达均显著升高(p<0.05),在Group 3中,各组各部位CIRP m RNA表达均无显著差异(p>0.05),经CIRP静默表达后,CIRP m RNA不受亚低温及药物影响。Western blot检测显示,脑皮层、海马、下丘脑三个部位,在Group 1,2中低剂量组、高剂量组较对照组CIRP蛋白表达均显著升高(p<0.05);MEK激活在Group 1,2,3中各组表达无显著差异(p>0.05);在Group 1,Group 2中ERK激活在低剂量组、高剂量组较对照组表达均显著降低(p<0.05),在Group 3中,各组及各部位ERK激活表达均无显著差异(p>0.05)。结论:应用参附注射液可能通过促进CIRP过表达,直接作用于ERK,降低ERK表达,抑制继发的转录因子磷酸化的启动信号转导,从而减少神经细胞凋亡,发挥其辅助亚低温治疗的抗凋亡作用。