辣椒疫霉Phytophthora capsici是一种土壤传播的植物病原体,具有多种宿主。病原体在宿主植物感染过程中分泌大量效应物,包括CRN、RxLR效应物,但其在病原菌中的作用机理仍然大部分未知。为此,本研究对辣椒疫霉RxLR效应因子及脱氢酶进行研究。辣椒疫霉侵染的作物主要包括辣椒、茄子、西红柿、黄瓜等茄科作物,在全国各地都有发生的报道。疫霉病发病迅速,发病范围大而广,对蔬菜的产量和品质造成极大的损失和影响。目前辣椒疫霉卵菌的主要防治手段是化学防治以及抗病品种种植,由于化学防治方面药剂单一,病原菌抗药性增强,因此,卵菌蛋白结构生物学为筛选新的药物靶点、设计低毒高效的杀菌药物提供了理论依据。我们通过解析辣椒疫霉RxLR效应蛋白的结构进行致病机制及功能的研究,利用基因克隆,将目的基因RxLR98344构建到pET28a载体上;采用最常用且效率高的原核表达系统,大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主,IPTG诱导目的蛋白表达;通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析等技术进行蛋白纯化;运用气相扩散法坐滴法和悬滴法两种方法筛选目的蛋白晶体;最后通过X-ray衍射进行数据的收集,并将得到的高质量数据进行目的蛋白三维结构的解析。硫胺素焦磷酸(ThDP)在植物或动物体内常作为一种辅酶,帮助其受体蛋白催化和转运底物,在生命体生长代谢过程中起着不可或缺的作用。PcUE1是在辣椒疫霉卵菌中首个发现的ThDP-依赖型酶。目前,我们已经拿到了PcUE1的三级结构,其结构特征表明PcUE1与其它菌体中的NAD~+依赖型醇脱氢酶具有较高的相似性。经进一步分析发现PcUE1的三级结构催化中心构象与ThDP-依赖型酶的不同,此外PcUE1三级结构中没有看到NAD~+辅因子的结合。根据其三维结构构象及特点,我们推测了18种可能底物,并利用动力学紫外分光光度计及高效液相色谱进行酶活测定分析。主要研究结果如下:(1)从辣椒疫霉基因组SD33中克隆了RxLR98344的目的基因,RxLR98344效应分子的N端包括RxLR-DEER保守区,C端为效应区,符合RxLR效应分子的序列特征。将RxLR98344克隆构建到带有His标签的pET28a原核表达载体上,在大肠杆菌内诱导进行大量表达;(2)RxLR98344蛋白经镍柱亲和层析、阳离子交换层析和分子筛层析后,得到了较高纯度且较均一的母体蛋白溶液和硒代蛋白溶液;通过气相扩散坐滴法和悬滴法,采用Hampton结晶试剂盒进行蛋白晶体结晶条件的筛选,通过X-ray衍射得到分辨率为2.6?的RxLR98344母体蛋白数据;硒代蛋白晶体正在进行进一步收集硒代数据。(3)RxLR98344不能引起本氏烟(Nicotiana benthamiana)的细胞死亡,不能够引起HR反应。RxLR98344分别与INF1、Bax、CRN4共表达结果表明,RxLR98344能够抑制Bax,不能抑制INF1、CRN4引起的细胞坏死。(4)通过解析PcUE1突变体三维结构以及质谱分析发现其结合NAD~+辅因子。此外,根据其结构构象特点,我们预测了18种底物,并通过动力学紫外分光光度计及高效液相色谱进行了酶活测定分析。发现PcUE1可能作为NADH依赖型脱氢酶,参与氧化还原的可逆反应,并初步测定其还原底物为间硝基苯乙酮、对硝基苯乙酮。