植原体(phytoplasma)是一种没有细胞壁的植物病原细菌,寄主范围十分广泛,侵染多种果树、林木和花卉植物。植原体目前尚无法在体外培养导致其研究受到限制。植原体病害在我国发生很普遍,如山东、陕西、云南等地都有很多植原体病害的报道,而近年来江苏地区却鲜有这方面的研究。本研究对南京部分地区的疑似植原体病害进行了检测和鉴定,对其中导致构树黄化卷叶病的植原体进行了较详细的研究,包括植原体对寄主的抗氧化相关酶的影响、致病相关的TENGU基因、抗原膜蛋白的表达、分泌系统等,为进一步了解植原体与寄主的相互作用,从分子水平揭示植原体的致病机理提供重要依据。本研究首次发现16SrI组植原体侵染构树造成构树叶片黄化、卷叶、畸形等症状,植原体侵染造成的桑树白化、凌霄白化、三角槭黄化病也是国内首次报道。主要研究结果如下:(1)构树黄化卷叶病等植原体的鉴定:用植原体16SrDNA、核糖体蛋白基因(rp)和转录延伸因子基因(tuf’)的通用引物对疑似植原体感染的构树总DNA进行直接PCR和巢式PCR扩增并測序验证。结果表明,构树叶片黄化卷叶症状与植原体感染有关,该植原体上述特定的基因序列与16S rl-B组中翠菊黄化菌株AY-27(HM467127.1)的相关序列高度同源,命名为构树黄化卷叶病(NJBP)植原体。此外,本研究还发现由植原体引起的三角槭黄化病、桑树白化病、凌霄白化病和国槐丛枝病等,经鉴定,桑树白化、凌霄白化和国槐丛枝植原体属于16SrV组,而三角槭黄化植原体属于16S rl组。(2)构树黄化卷叶病植原体TENGU基因功能的初步研究:通过PCR扩增从构树黄化卷叶病植原体中克隆到TENGU基因,将该基因连接到pCAMBIA1302植物表达载体上构建重组表达载体pCAMBIA1302-TENGU,应用蘸花法将该重组载体转染拟南芥。结果含TENGU基因的pCAMBIA1302重组载体通过农杆菌GV3101转染到拟南芥基因组中并成功表达,得到的转基因拟南芥表现为矮化或丛枝症状,证明构树黄化卷叶病植原体的TENGU基因与寄主的表型症状相关。(3)构树黄化卷叶病植原体sec分泌系统3个亚基的克隆及其生物信息学分析:采用PCR方法扩增了构树黄化卷叶病植原体sec分泌系统的3个亚基secA、secY和secE的基因,并进行了生物信息学分析。secA、secY和secE基因全长分别为2508 bp,1358 bp和450 bp,分别编码835个、413个、136个氨基酸的蛋白质。SecA为亲水性蛋白,secY和secE均为疏水性蛋白质,且在这3个蛋白的二级结构中,α螺旋结构所占比重最高。构建的三维结构中,secA和secY符合立体化学规则;secE三维结构可靠性分析小于30%,未能建模成功。对这些亚基的亲疏水性及蛋白质的结构分析,为进一步在分子水平上研究构树黄化卷叶病植原体的毒力因子及其分泌方式奠定基础。(4)构树黄化卷叶病植原体抗原膜蛋白Amp基因的原核表达:为研究构树黄化卷叶病植原体Amp蛋白的功能,应用PCR扩增到抗原膜蛋白Amp基因,将该基因片段纯化后与pET-28a(+)载体相连接并体外原核表达。结果成功克隆了构树黄化卷叶病植原体的抗原膜蛋白Amp基因,但是该基因全长却无法在大肠杆菌中表达。由于Amp基因是由3个部分组成,包括N端输出序列、中间亲水域和C端跨膜区域,分别将切去N端信号肽的剩余部分和切除两端后的剩余部分进行表达,发现这两段可以在大肠杆菌中很好的表达,纯化后的这些表达产物可用于进一步研究抗原膜蛋白的功能。(5)感染植原体的构树抗氧化相关酶活的变化:植物受病原菌感染后通常会产生一系列抗氧化相关的防御反应,为了解构树感染植原体后抗氧化相关的防御反应,本研究比较了感病构树和健康构树叶片的多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性以及丙二醛(MDA)含量随月份的变化。结果表明,在相同的生长季节(4～9月),染病构树的PPO、POD、SOD酶活及MDA含量均大于健康构树,而在10月份,POD、SOD酶活及MDA含量却表现出相反的情况;CAT的变化趋势与POD酶活变化相反。表明构树通过改变抗氧化相关酶的活性来应对植原体感染导致的氧化胁迫。