现代应激概念认为:应激是一种当机体内环境稳定受到威胁时,机体对应激源产生特异性和(或)非特异性反应。应激的启动以一系列的反应体现出来,这些反应包括分子水平上的生物化学反应,激素水平层面上的调控以及系统整合方面的行为、情绪和认知的变化等等,统称为应激反应。应激作为发病机制已经涉及临床各科,特别是心血管疾病、神经精神病、胃肠疾病和内分泌疾病等高发病率的疾病与应激密切相关,也对人的学习和认知过程产生影响。因此众多研究者一直想把应激状态客观地测量出来,以便定量地观察应激过程。由于至今没有一种方法能全面、准确地对应激状态进行评估。因此,进一步探讨应激反应规律,不断改进和完善应激评估指标,对准确测量应激反应、预防应激对机体造成的损害有重要意义。目前用于应激研究的生化物质主要有儿茶酚胺类、糖皮质激素(主要是皮质醇)、唾液α-淀粉酶。检测的生物样本包括组织、脑脊液、血液、尿液、唾液等,对于人体研究,研究报道最多的是血液,然而抽血本身是一种急性应激源,亦可能造成人体应激反应,导致生化指标瞬时变化。近年来唾液样品的测定在精神神经内分泌研究中显得日益重要,唾液.采集无创伤、简便、易被接受,尤其适合幼儿研究。此外,研究证实头发皮质醇是一种研究长期HPA轴活性很好的工具,可以客观测量慢性应激,所以头发样本分析也必将成为生理学、精神医学、体育医学、认知科学、心理学等众多领域的研究手段之一。　　 本文开展了以下五个主要内容的研究工作:(1)唾液中皮质醇的高效液相色谱.荧光检测方法;(2)头发中皮质醇高效液相色谱.荧光检测方法:(3)唾液α-淀粉酶含量的流动注射分析方法;(4)尿液中儿茶酚胺选择性提取高效液相色谱—电化学检测方法:(5)人体应激实验生物样本测定,唾液皮质醇和唾液α-淀粉酶两种应激生物标志物比较研究。　　 本课题的研究将为为生理学、精神医学、体育医学、认知科学、心理学研究提供知识和技术支持。　　 论文主要工作如下:　　 一、生物样本中目标物前处理方法的研究　　 采用本实验室研制的几种纳米纤维作为固相萃取柱的吸附剂,填装固相微萃取小柱开展了基于纳米纤维的固相萃取(Packed-fiber solid-phase extraction,PFSPE)样品前处理研究,内容包括生物样品中目标物的提取和杂质净化去除两方面的研究:　　 (1)以聚苯乙烯电纺纳米纤维为萃取介质,分离提取唾液和头发浸出液中皮质醇,提取回收效率近100％,操作快速、高效。此外,用PFSPE法提取皮质醇强酸衍生物,效率远高于文献报道的溶剂提取法,很好的解决了衍生物需要快速与反应介质分离,确保衍生物稳定性的难题,并且克服了文献报道方法提取回收率低、净化效果差的缺点,不仅使得检测灵敏度提高、干扰减少,而且提取过程简便、快速、环保。　　 (2)采用合成的聚冠醚与聚苯乙烯高分子混合电纺,制备出一种新型的纳米纤维材料,用此材料为萃取介质装填固相萃取小柱,对儿茶酚胺类物质进行提取分析研究,构建了尿液生物样品中儿茶酚胺类物质高效分离、净化、富集于一体的快速样品前处理方法。　　 (3)比较了不同成分纳米纤维和脱脂棉去除唾液中粘性物质的效率,掌握了用PFSPE方法去除大分子粘性物质的方法,为实现唾液样品自动化前处理研究奠定了基础。　　 二、优化柱前衍生化—高效液相色谱法,建立唾液和头发中皮质醇的测定方法　　 皮质醇本身具有紫外吸收,血液样品可以色谱分离后直接用紫外检测器检测,但是唾液样本中皮质醇的含量比血液及尿液中的含量低约两个数量级,通常人体唾液早晨的含量约为1.0-8.0 ng/mL,夜晚更低只有0.1-1.0ng/mL左右,因此紫外检测法不能满足唾液中皮质醇检测的要求。本研究选用柱前衍生试剂——硫酸/乙醇溶液,先将皮质醇衍生为具有较强荧光强度的衍生产物,然后通过测定皮质醇衍生产物的荧光强度对皮质醇进行定量分析。　　 本文对于作者硕士期间建立的唾液皮质醇高效液相色谱-荧光(HPLC-Flu)测定方法进一步优化操作程序(包括唾液黏性物去除,PFSPE提取、皮质醇硫酸衍生,色谱分析内标物确定)。采用色谱柱为迪马C18(4.6×250mm,5um),硫酸/乙酸溶液为柱前衍生试剂,流速为1.0 mL/min,荧光检测器检测。皮质醇在0.05～20 ng/mL范围内,线性关系良好(r=0.9997),本方法简便、快速、准确,可用于唾液中皮质醇的测定。　　 此外,本文优化改进了头发样本前处理操作,用柱前衍生化.高效液相色谱法实现了人体头发中皮质醇和动物毛发中皮质酮的高灵敏检测。　　 三、唾液α-淀粉酶流动注射分析方法建立　　 本文建立了一种快速、简便的基于流动注射光度法测定唾液α-淀粉酶的方法。该方法测定一个样本的周期仅为58s,可以实现自动化操作,精密度高,避免人工操作上时间控制不当所导致的测定差异大的缺点。用所建的方法测定运动应激实验前后的唾液样本,能较好的监测到应激过程,且方法重现性较好。　　 四、尿液儿茶酚胺PFSPE提取HPLC-ECD检测方法研究　　 本文采用静电纺丝技术制备聚冠醚-聚苯乙烯(PCE-PS)复合纳米纤维,相比文献用化学合成的方法制备冠醚聚苯乙烯树脂不仅操作简单方便、化学试剂用量少,而且用于SPE的填料使用量也大大减少,本方法只需2mg左右的纤维,而文献方法需要70rag左右的改性树脂。所以本实验所需要的相应活化、洗脱溶剂量也可以大大的减少。此外,本实验不需要氮气吹干就可以达到浓缩样品的目的,而文献中由于洗脱溶剂要1mL,如果不吹干复溶,就无法达到浓缩富集目标物的目的。本文通过实验对比、图谱表征,并广泛查询文献,探讨了PCE-PS复合纳米纤维对儿茶酚胺类化合物的吸附机理。此外,采用PCE-PS复合纳米纤维装填的PFSPE柱处理尿液,不仅对目标物提取效果良好,而且能够去除尿液中的大多数干扰物质,实现了尿液中几种儿茶酚胺物质的选择性提取。　　 五、人体应激实验生物样本测定,唾液中皮质醇和唾液α-淀粉酶两种应激生物标志物比较研究　　 本文主要采用三个条件的应激实验,包括公开演讲实验、运动应激实验和考试焦虑被试对注意偏向抑制实验,取被试自然流出的混合唾液作为测试样本,进行唾液中皮质醇和唾液α-淀粉酶两种应激生物标志物比较研究。比较确定人体不同模式应激高度相关生物标志物,对应激反应进行量化分析,改进和完善应激评估指标。