桡足类特异性遗传标记的设计、评估及其在群落生态学研究中的应用

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桡足类是广泛分布于海洋及淡水生态系统的一类小型甲壳动物。作为浮游生物群落中的主要类群之一,桡足类是联系水生态食物链中初级生产与高级消费者的重要环节,在水环境中发挥着重要的生态学功能。研究桡足类群落多样性对理解水体生态系统的功能与监测水环境变化有重要价值。采用传统形态学鉴定方法进行群落多样性调查比较耗时,且需要具备专业的分类学知识和经验。桡足类等生物类群具有变态发育特征,其幼体阶段的样本难以通过形态学特征进行鉴定,另外,雌雄异型的形态特征和大量隐蔽种的存在,都增加了桡足类群落生态学研究的难度。分子分类学的兴起及相关技术的引入为生物多样性研究注入了新鲜血液。分子生物学技术有望成为浮游生物群落多样性研究的重要工具。  本研究旨在探究一种用于快速分析桡足类特定类群的群落组成的分子生物学方法,并将其应用于东湖桡足类群落多样性研究。研究内容包括遗传标记的设计、分类解析能力的评估和在东湖桡足类群落研究中的实践。获得的主要研究结果如下:  (1)对桡足类18S rRNA基因进行扫描,在V2和V3区之间找到一段桡足类类群特异性序列,并设计了匹配的正反特异性引物;将特异性引物与其他区域的引物进行组合扩增不同长度和位置的18S rRNA基因片段,用于DGGE检测,找到一段适合用于DGGE检测并且特异性良好的片段;该片段包括V1-2两个高变区,由特异性反向引物和上游的通用引物扩增;GC夹板需加在特异引物的5端才能获得清晰分辨的DGGE指纹。  (2)分析了桡足类18S rRNA基因序列不同区域的变异情况,其中V2、V4、V7和V9区在不同桡足类物种间的变异较高,适合作为桡足类生物多样性研究的候选标记;评估了不同区域18S rRNA基因序列片段的对不同分类阶元的解析能力,结果表明18S rRNA基因的全长序列及不同高变区片段都适合桡足类科及以上阶元的分辨(准确率在95%),若序列相似度低于100%,则该基因对种或属水平的分辨准确率均低于95%。  (3)对东湖五个样点的桡足类群落结构的周年变化及其与理化因子的相关性进行了研究:东湖桡足类群落以幼体为主,其数量和生物量均显著高于桡足类成体;通过形态学鉴定共发现桡足类15种,其中以剑水蚤为主,还有两种哲水蚤、一种猛水蚤及一种寄生类水蚤;采用本研究设计的特异性遗传标记,通过PCR-DGGE同检测到26个不同位置的条带(OTU),测序了其中14个,得到35条有差异的序列,通过BLAST匹配到10种不同的桡足类;聚类分析发现,桡足群落组成的相似性以夏秋两季和春冬两季各自聚集,物种组成的聚类和OTU组成的聚类趋势大体一致;对桡足类群落组成与理化因子相关性分析发现:同桡足类物种组成和OTU组成显著相关的理化因子基本一致,主要是温度、氨氮和重金属砷(与OTU组成相关的还有汞);但不同理化因子对物种和OTU组成的影响力不同,与物种组成最相关性的是温度,而与OTU组成最相关的为重金属砷和汞。
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