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研究背景：非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，NSCLC的标准治疗方法包括手术切除，化疗和放射治疗，由于大多数癌症患者被发现时已处于癌症晚期，化疗被认为是治疗癌症的中坚力量。紫杉醇是紫杉烷抗有丝分裂剂，由于具有良好的肿瘤杀伤作用，其作为晚期NSCLC的一线治疗方案，在临床上已经使用多年。然而，经过一段时间的治疗后，肿瘤细胞常会通过多种机制对紫杉醇产生耐药性，这种耐药现象的发生严重限制了紫杉醇的临床化疗效果。多项研究表明，P-糖蛋白（(P-glycoprotein,P-gp)的过表达是肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药的最常见和最重要的因素之一。P-gp是一种独特的ATP依赖性膜转运蛋白,在人体中存在两种P-gp基因，即MDR1和MDR2，MDR2的功能尚未确定，MDR1的过表达往往导致肿瘤细胞产生耐药性。目前，临床上解决P-gp过表达所采用的第一种方法是将P-gp抑制剂与化疗药联用。虽然已经有三代P-gp抑制剂，但是由于毒副作用较大，体内实验效果不好等原因，能用于临床且有效的少之又少。伊曲茶碱(Istradefylline,KW-6002)，2013年作为选择性腺苷A2A受体拮抗剂在日本上市。此公司在考察其药物间相互作用时，发现其可以抑制P-gp的活性，且多项研究显示，伊曲茶碱具有良好的安全性。但是在逆转肿瘤细胞化疗药耐药方面尚未见研究，其抑制P-gp活性的作用机理尚无报道。本研究发现了伊曲茶碱可以体内外逆转A549/Taxol细胞的紫杉醇耐药，且其能够通过降低MDR1蛋白和MDR1mRNA的表达来抑制P-gp的活性。
目的：评价化合物伊曲茶碱体内外逆转肺腺癌细胞A549/Taxol紫杉醇耐药的药理活性，并考察其可能的机制。
研究方法：
1.首先选择MDR1蛋白高表达的紫杉醇耐药肺腺癌细胞株A549/Taxol细胞和对紫杉醇敏感的A549细胞，并通过MTT实验验证其耐药性，通过qRT-PCR和WesternBlot实验检测A549/Taxol细胞和A549细胞中MDR1的表达水平。
2.MTT实验筛选伊曲茶碱对两细胞的非毒剂量，作为其体外实验联用浓度。
3.MTT初步测定伊曲茶碱联合紫杉醇对A549/Taxol细胞的耐药逆转作用，并以紫杉醇敏感细胞A549细胞作为对照。
4.通过细胞形态学实验，流式细胞术检测细胞凋亡实验，流式细胞术检测细胞周期实验以及细胞迁移实验研究伊曲茶碱联合紫杉醇对A549/Taxol细胞的细胞形态学，细胞凋亡，细胞周期和细胞迁移的影响，进一步研究伊曲茶碱体外逆转A549/Taxol细胞紫杉醇耐药的药理活性，并以紫杉醇敏感细胞A549细胞作为对照。
5.通过qRT-PCR和WesternBlot实验检测伊曲茶碱对MDR1mRNA和MDR1蛋白表达水平的影响，WesternBlot实验检测各实验组细胞凋亡和细胞周期相关蛋白的表达水平，研究伊曲茶碱逆转耐药的可能的作用机制。
6.体内实验：我们用A549/Taxol细胞建立了裸鼠皮下异种移植动物模型，以评价伊曲茶碱是否具有体内逆转紫杉醇耐药的作用。
结果：
1.A549/Taxol细胞对紫杉醇具有明显的耐药性，耐药指数(RI)为32.45；且该细胞中MDR1mRNA和MDR1蛋白呈现高表达水平；A549细胞为紫杉醇敏感细胞且细胞中几乎不表达MDR1。
2.伊曲茶碱浓度为10μM及以下时，对两种细胞的抑制率均小于5%，认为该浓度下的化合物伊曲茶碱对两种细胞均无毒性作用，我们选择1μM，5μM，10μM作为后续体外实验中伊曲茶碱的联用浓度。
3.MTT实验结果初步确定伊曲茶碱具有逆转A549/Taxol细胞紫杉醇耐药的作用。
4.细胞形态学实验，细胞周期，细胞凋亡以及Transwell小室实验结果均显示：对于A549/Taxol细胞，伊曲茶碱能明显增加紫杉醇的敏感性；对于A549细胞，联用与单独作用相比，紫杉醇的抗肿瘤作用并未增强。
5.qRT-PCR实验结果和WesternBlot实验结果显示，伊曲茶碱能够以时间和浓度依赖性降低MDR1mRNA的表达水平，同时也能以时间和浓度依赖性地降低MDR1蛋白的表达水平。
6.在A549/Taxol细胞中，与单独作用相比，伊曲茶碱和紫杉醇联用处理能够显著增加cleavedcaspase3蛋白的表达，降低bcl-xl蛋白的表达水平，和降低CDK1蛋白，cyclinB1蛋白的表达水平。对于A549细胞，联合用药组与紫杉醇单独处理组都能显著增加cleavedcaspase3蛋白的表达，降低bcl-xl蛋白的表达水平和降低CDK1蛋白，cyclinB1蛋白的表达，且两组间结果无明显差异。
7.裸鼠皮下异种移植动物模型结果显示，与单独用药组比较，伊曲茶碱和紫杉醇联用能够明显抑制裸鼠皮下肿瘤的生长,且联用组明显诱导了肿瘤组织中cleavedcaspase3的表达；即伊曲茶碱具有逆转体内A549/Taxol细胞紫杉醇耐药的作用。
结论：伊曲茶碱能够体内外逆转A549/Taxol细胞的紫杉醇耐药。并且发现伊曲茶碱可以通过降低MDR1蛋白和MDR1mRNA的表达来抑制P-gp的活性。在此研究中，伊曲茶碱能够增敏紫杉醇对MDR1高表达的耐药细胞A549/Taxol的毒性作用，而不能增加几乎不表达MDR1的A549细胞的紫杉醇敏感性，进一步研究发现伊曲茶碱能以时间和浓度依赖性降低MDR1mRNA和MDR1蛋白的表达，因此伊曲茶碱的该逆转耐药作用，可能主要是通过降低MDR1mRNA和蛋白的表达水平，使进入A549/Taxol细胞内的紫杉醇浓度增加，增加了紫杉醇对耐药细胞的毒性，从而逆转A549/Taxol细胞紫杉醇耐药。
目的：评价化合物伊曲茶碱体内外逆转肺腺癌细胞A549/Taxol紫杉醇耐药的药理活性，并考察其可能的机制。
研究方法：
1.首先选择MDR1蛋白高表达的紫杉醇耐药肺腺癌细胞株A549/Taxol细胞和对紫杉醇敏感的A549细胞，并通过MTT实验验证其耐药性，通过qRT-PCR和WesternBlot实验检测A549/Taxol细胞和A549细胞中MDR1的表达水平。
2.MTT实验筛选伊曲茶碱对两细胞的非毒剂量，作为其体外实验联用浓度。
3.MTT初步测定伊曲茶碱联合紫杉醇对A549/Taxol细胞的耐药逆转作用，并以紫杉醇敏感细胞A549细胞作为对照。
4.通过细胞形态学实验，流式细胞术检测细胞凋亡实验，流式细胞术检测细胞周期实验以及细胞迁移实验研究伊曲茶碱联合紫杉醇对A549/Taxol细胞的细胞形态学，细胞凋亡，细胞周期和细胞迁移的影响，进一步研究伊曲茶碱体外逆转A549/Taxol细胞紫杉醇耐药的药理活性，并以紫杉醇敏感细胞A549细胞作为对照。
5.通过qRT-PCR和WesternBlot实验检测伊曲茶碱对MDR1mRNA和MDR1蛋白表达水平的影响，WesternBlot实验检测各实验组细胞凋亡和细胞周期相关蛋白的表达水平，研究伊曲茶碱逆转耐药的可能的作用机制。
6.体内实验：我们用A549/Taxol细胞建立了裸鼠皮下异种移植动物模型，以评价伊曲茶碱是否具有体内逆转紫杉醇耐药的作用。
结果：
1.A549/Taxol细胞对紫杉醇具有明显的耐药性，耐药指数(RI)为32.45；且该细胞中MDR1mRNA和MDR1蛋白呈现高表达水平；A549细胞为紫杉醇敏感细胞且细胞中几乎不表达MDR1。
2.伊曲茶碱浓度为10μM及以下时，对两种细胞的抑制率均小于5%，认为该浓度下的化合物伊曲茶碱对两种细胞均无毒性作用，我们选择1μM，5μM，10μM作为后续体外实验中伊曲茶碱的联用浓度。
3.MTT实验结果初步确定伊曲茶碱具有逆转A549/Taxol细胞紫杉醇耐药的作用。
4.细胞形态学实验，细胞周期，细胞凋亡以及Transwell小室实验结果均显示：对于A549/Taxol细胞，伊曲茶碱能明显增加紫杉醇的敏感性；对于A549细胞，联用与单独作用相比，紫杉醇的抗肿瘤作用并未增强。
5.qRT-PCR实验结果和WesternBlot实验结果显示，伊曲茶碱能够以时间和浓度依赖性降低MDR1mRNA的表达水平，同时也能以时间和浓度依赖性地降低MDR1蛋白的表达水平。
6.在A549/Taxol细胞中，与单独作用相比，伊曲茶碱和紫杉醇联用处理能够显著增加cleavedcaspase3蛋白的表达，降低bcl-xl蛋白的表达水平，和降低CDK1蛋白，cyclinB1蛋白的表达水平。对于A549细胞，联合用药组与紫杉醇单独处理组都能显著增加cleavedcaspase3蛋白的表达，降低bcl-xl蛋白的表达水平和降低CDK1蛋白，cyclinB1蛋白的表达，且两组间结果无明显差异。
7.裸鼠皮下异种移植动物模型结果显示，与单独用药组比较，伊曲茶碱和紫杉醇联用能够明显抑制裸鼠皮下肿瘤的生长,且联用组明显诱导了肿瘤组织中cleavedcaspase3的表达；即伊曲茶碱具有逆转体内A549/Taxol细胞紫杉醇耐药的作用。
结论：伊曲茶碱能够体内外逆转A549/Taxol细胞的紫杉醇耐药。并且发现伊曲茶碱可以通过降低MDR1蛋白和MDR1mRNA的表达来抑制P-gp的活性。在此研究中，伊曲茶碱能够增敏紫杉醇对MDR1高表达的耐药细胞A549/Taxol的毒性作用，而不能增加几乎不表达MDR1的A549细胞的紫杉醇敏感性，进一步研究发现伊曲茶碱能以时间和浓度依赖性降低MDR1mRNA和MDR1蛋白的表达，因此伊曲茶碱的该逆转耐药作用，可能主要是通过降低MDR1mRNA和蛋白的表达水平，使进入A549/Taxol细胞内的紫杉醇浓度增加，增加了紫杉醇对耐药细胞的毒性，从而逆转A549/Taxol细胞紫杉醇耐药。