CRISPR/Cas系统,成簇的规律间隔的短回文重复序列,广泛存在于真细菌和古生菌中,是一个用来保护宿主不受病毒二次侵害的获得性免疫系统。该系统由CRISPR体系转录出的RNA和Cas体系翻译出的蛋白相结合来发挥切割DNA的作用。目前在基因组编辑领域应用最为广泛的CRISPR/Cas系统是II型的SpCas9系统,它使用crRNAs与tracrRNAs嵌合形成的引导RNA与核酸酶Cas9组成复合体来识别、切割DNA,在基因组的特定位点造成DNA双链断裂。DNA受到断裂损伤时会引发非同源末端连接(NHEJ)、同源重组(HR)等修复通路的开启,最终会在外显子区插入或缺失DNA片段,从而形成移码突变。相较于ZFNs和TALENs,CRISPR/Cas9系统以其极度简单、低构建成本等优势,迅速成为了基因组编辑的主流技术,并普及发展成为了现代生命科学实验室必不可少的研究工具之一。但正是Cas9极度简单的特性也造成了其潜在的生物安全性问题,加上目前陆续报道的脱靶效应,极大地限制了CRISPR/Cas9技术的进一步应用。经过几十年的发展,非天然氨基酸引入技术日趋完善,目前除了George M.Church和Farren J.Isaacs鲜有将位点特异的非天然氨基酸引入技术应用到生物安全领域的报道,且应用范围仅限于原核生物,对于多细胞真核生物的报道还未曾提及。为此,基于CRISPR/Cas9安全性和特异性的欠缺以及非天然氨基酸引入技术的优势,我们将位点特异的非天然氨基酸引入技术应用到CRISPR/Cas9系统中,利用外源非天然氨基酸控制Cas9蛋白的表达,将其存在形式限制在了RNA水平,将其表达时间控制在了任何想要的时间,保证了Cas9在基因敲除时的安全性。另外,我们建立的非天然氨基酸控制的CRISPR/Cas9系统可以降低Cas9蛋白在基因打靶时存在的脱靶效应,为降低脱靶效应提供了新的解决方案。本论文取得的主要结果和结论如下:1、建立了细胞内定点引入非天然氨基酸的方法鉴于非天然氨基酸引入技术已在细菌、酵母、哺乳动物细胞、果蝇等物种成功的建立,我们以上述成功案例的引入方法为参照,获得主要结果如下:(1)选定nε-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸(h-lys(boc)-oh,bock)作为引入的对象,再通过引入外源pylrs/trnatag对,在家蚕细胞系建立起可以引入这种非天然氨基酸的dsred-tag-egfp报告系统。通过荧光显微镜观察发现当且仅当添加bock时,才能同时检测红色和绿色荧光信号;westernblot进一步证实融合蛋白也只在有bock加入时才可以表达。上述结果证明了我们构建的这一体系可以在tag终止密码处引入非天然氨基酸,并且tag既可以通过bock的加入开放绿色荧光蛋白的表达,同时又可以作为终止密码结束“融合mrna”(dsred-uag-egfp)对绿色荧光蛋白的翻译。(2)随后,我们利用293ft细胞系在cas9基因中同样插入tag,westernblot实验显示cas9*(tag-cas9)只有在bock存在时才能够表达,证实了在crispr/cas9*系统也同样能够定点引入非天然氨基酸。2、提出并证实了利用非天然氨基酸可提高crispr/cas9*系统的安全性细菌是最早被实验室开发利用的模式生物,目前在医药生产、生物能源、生物降解等方面已经得到广泛应用,而转基因细菌的逃逸不可避免会对生态环境造成干扰,最近非天然氨基酸引入系统在细菌安全防控领域做出了更进一步的努力,鉴于crispr/cas9系统在基因组编辑领域遇到的相似困境,我们提出非天然氨基酸引入系统是否同样可以解决cas9蛋白遇到的潜在安全性问题。于是首先我们利用ssa体系检测了cas9*的核酸酶活性,通过比较,证实了非天然氨基酸确实可以明显控制它的活性,westernblot和rt-pcr实验进一步证实了在没有非天然氨基酸的条件下cas9*只能转录不能翻译,说明非天然氨基酸可作为一种分子开关,通过外源添加的方式确实可以精确控制cas9*蛋白表达的开启和关闭,从而提高基因组编辑时的安全性。3、利用非天然氨基酸可提高crispr/cas9*系统的特异性脱靶效应一直是束缚crispr/cas9系统应用于疾病治疗和分子育种的主要限制因素,虽然最近一年来陆续报道了一些降低脱靶效应的策略,但目前还没有一种切实可行的方案能够完全在全基因组、全位点消除这一束缚。在利用非天然氨基酸引入系统解决crispr/cas9*安全性研究的基础上,本文又进一步对其脱靶效应做出探究。通过对哺乳动物细胞系vegfa、emx1和293-4三个基因同一位点不同时间点的连续测序证实了伴随野生型cas9蛋白的表达时间延长,其脱靶效应也逐渐提高。这一发现也提示我们,如果将cas9*的表达限制在特定的时间范围可能会提高其特异性。通过特定位点测序发现,在转染后0-12h内添加非天然氨基酸可以有效的降低其脱靶效应,在转染后19-30h内添加非天然氨基酸更是可以在某位点的脱靶效应降低到不可检测的水平。综上所述,我们首次通过遗传密码扩展,在CRISPR/Cas9系统中位点特异性的引入非天然氨基酸,并把非天然氨基酸作为可控的分子开关控制Cas9蛋白由转录到翻译的过程,保证了基因组编辑时的安全性。另外,通过该开关机制也降低了CRISPR/Cas9*的脱靶效应。该系统的建立将对基因组编辑体系的应用范围的扩展起到铺垫性的作用,相信CRISPR/Cas9系统的不断优化会使其成为一个安全、准确、高效而且应用范围更广的技术工具。