目前结核分枝杆菌(Mycobacterium)仍然是严重危害人类健康的重要病原微生物,其每年在全球范围内引起超过一千万人口的感染并导致约三百万人口的死亡。随着近年来结核分枝杆菌耐药株的不断出现以及BCG作为目前唯一用于预防结核病的疫苗,存在免疫保护效果不稳定;接种后使结核菌素试验呈阳性,干扰结核病的诊断,延误治疗时机;免疫功能缺陷患者如艾滋病等接种后可能引起严重的散播性结核病等多方面的原因,发展更安全、高效、低成本、并可广泛用于各类人群的新型结核病疫苗已经成为结核病预防工作中的当务之急。同时,结核病也是人猴共患疾病之一,对人工饲养猴群的健康危害极大,人类结核病一旦感染猴群,呈爆发性疾病,可造成整个猴群的毁灭。缺乏敏感而特异的结核检疫方法是造成实验猴结核预防管理困难的原因之一,许多发达国家控制动物结核病的传统策略“检验-屠宰”,在某些自然疫源再感染可能性较大的情况下是失败的,同时带来惨重经济后果(隔离、活动控制、宰杀)通常是在缺少临床体征和症状的情况下仅根据感染的证据(如目前的实验动物检疫主要采用的是皮内进行结核菌素试验)决定的,而且由于人猴交叉感染,对饲养员及工作人员的健康也造成威胁;除此之外,现有的人用卡介苗(BCG)在预防猴针对牛型和人型结核分枝杆菌感染的能力上存在很大差异,目前也尚无用于预防猴类结核病的疫苗,所以对兽用新疫苗的需要显得更为迫切。因此,对于人工饲养猴群的繁殖和管理,对防止结核病在猴群中的传播和确保猴质量,也都亟待拓展兽类专用的疫苗和猴结核病检测的方法。借鉴在人结核疫苗研制方面的技术和成果,致病菌中的单个或多个抗原表位能够通过蛋白多肽或DNA疫苗的方式进行免疫从而获得免疫保护作用,在结核分枝杆菌中理想的抗原应是在结核分枝杆菌感染初期被识别的抗原。已知人用亚单位疫苗研究中有明显作用及部分作用的分泌型蛋白有:早期分泌性抗原靶6(ESAT6)、抗原85复合体(Ag85)、MPB64以及热休克蛋白HSP65等,其中Ag85蛋白复合体是近年来研究的热点。Ag85B是Ag85复合体中一种重要的分泌型蛋白,是人体抗结核T细胞免疫反应的主要靶分子,这使其成为最具潜力的疫苗候选蛋白之一。在豚鼠模型中纯化的Ag85B蛋白也能够诱导持续的抗结核免疫保护,并且当使用表达分泌Ag85B蛋白的重组卡介苗免疫动物时显示出比传统的卡介苗更强大的针对结核分枝杆菌气溶胶攻击的保护。表位疫苗是近年发展起来的一种崭新的免疫接种技术,以保护性抗原上的特异性表位为基础进行疫苗分子设计,并以抗原表位为靶抗原,既能诱生特异性免疫应答,又避免了天然蛋白中抑制性抗原表位引起的免疫抑制,使免疫应答具有更强的特异性和更好的免疫效果,且不存在生物危害性和遗传变异致疫苗效力丧失等问题,因此,表位疫苗已成为研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。因此,借鉴表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果,选择在人类结核疫苗研究中具有免疫原性的抗原进行合理的表位预测,以此表位为基础设计的疫苗由于其小分子、稳定和结构简单等特性,有可能打破机体产生的免疫抑制,防止自身免疫反应的发生,归避病原体因自身快速基因突变所形成的免疫逃避作用,达到预防和治疗结核分枝杆菌感染的目的。综上,本研究拟在人用结核分枝杆菌疫苗开发研究的基础上,利用猴结核分枝杆菌中存在的特有DNA序列尝试开展一种适用于猴结核病鉴定的准确而便捷的检测方法;同时,尝试对在人体中具有免疫保护性的相应猴基因进行克隆,从而进行保护性抗原表位的寻找和免疫原性初步研究,为猴的结核病预防和猴结核表位疫苗的开发提供有益的帮助,也为人用结核表位疫苗的开发开辟新的视野。我们首先根据本实验室自身特点建立了一套结核分枝杆菌猴鉴定的分子免疫学及细菌学基本技术,结合结核菌素实验和猴咽拭子涂片抗酸染色技术,能够较为准确的鉴定出野生猴来源中的携带结核分枝杆菌的个体,从而得以从这些个体中获得病理组织,提取其基因组。并通过标准株H37RV的Ag85B基因序列设计了引物用于扩增野生猴来源Mycobacterium阳性猴的相应基因。Blastn分析后发现,Ag85B基因在结核分枝杆菌多个种内菌株,以及多个同属不同种的菌株中高度保守,而在结核阳性猴中得到的Ag85B基因也与此共同序列有99.05%的相似性。基于此序列设计的抗原多肽必然能够起到针对多种结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的免疫保护作用。通过生物信息学方法的合理预测,筛选了抗原表位中能够为最多MHC分子提呈并且处于蛋白外部的序列进行人工合成,进行淋巴细胞增殖实验和抗体测试,结果显示此抗原表位能够有效的引起淋巴细胞增殖,有较好的免疫原性和抗原性。此外,鉴于猴的目前活检猴感染结核病的检疫方法主要为结核菌素试验。由于检测方法的单一性及敏感性和特异性低,加之结核病的变异性大,给灵长类结核病的诊断带来困难。本实验采用结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6克隆作为阳性对照而建立的鉴定方法,能够成功从活猴外周血中检测出ESAT-6基因的存在,从而检测出结核猴,通过ESAT-6 PCR的方法,我们在30只PPD阴性的野生来源猴小样本调查中鉴定出1只阳性猴,较之结核菌素测试更为简便和灵敏,通过进一步的改进和完善,将对猴群的养殖和管理带来很大的益处。通过上述工作,本研究证实Ag85B具有良好的免疫原性,应用生物信息学技术对菌体高免疫原性、高抗原性的蛋白基因进行分析,则是M.tuberculosis(Mtb)基因工程疫苗研发工作中一种较为合理有效的新辅助方法。用此技术筛选得到的抗原表位能够有效激发淋巴细胞增殖,有较好的免疫原性。这些工作为今后M.tuberculosis疫苗的进一步开发与研究在打下了一定的基础。本研究也成功建立了一种快速而便捷的猴结核鉴定的方法,为更好的预防和管理猴群打下了基础。