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红曲霉(Monasucsruber)是我国重要的微生物资源,能产生许多有用物质,如红曲色素、莫呐可啉类物质、酶和γ-氨基丁酸等。目前,国内外对红曲霉代谢产物和发酵条件的研究很多,但是对红曲霉分子生物学方面的研究还比较少。该课题建立了以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)为介导的转化红曲霉的方法,并初步研究了转化子的性质,为红曲霉分子生物学研究奠定了基础。主要研究结果如下:
1.对影响转化率的一些因素进行了优化,这些因素包括:红曲霉培养基种类、红曲霉培养时间、红曲霉孢子浓度、诱导剂乙酰丁香酮(AS)的浓度、D-半乳糖和AS联合使用的作用、根癌农杆菌浓度、共培养温度和共培养时间。通过优化建立了农杆菌的高效转化体系为:用PDA培养红曲霉20d后收集其孢子,孢子浓度为106/ml,诱导剂AS的浓度为80mmol/L,根癌农杆菌的浓度OD600为0.5,根癌农杆菌和红曲霉孢子于30℃共培养3d。采用此转化体系构建了含有5,100多个转化子的转化库。
2.提取1~10号转化子的DNA,根据T-DNA上已知Gus基因序列设计引物,进行PCR。结果证明转化子含有插入的T-DNA片段。
3.对转化子的遗传稳定性进行了分析。随机挑选14株转化子,在PDA和含50mg/L潮霉素的PDA上分别传代6次;同时,将转化子7号和9号的孢子适当稀释后分别涂布在PDA和含50mg/L潮霉素的PDA上传代4次,观察菌落形态。结果表明转化子在遗传上基本是稳定的。
4.将5,100多个转化子接种于PDA上,30℃培养14~30d,观察并筛选菌落形态和显微特征变异明显的转化子。结果得到32株菌落颜色、气生菌丝、菌落隆起和生长速度都和出发菌株有明显差异的转化子。其中16株的显微形态有较大变异,这些变异包括:闭囊壳壁的厚度、分生孢子的形状、菌丝表面颗粒形状等。
5.随机挑选7株变异转化子,分别接种于米饭培养基,30℃培养14d后,测了它们的色价,并采用紫外可见扫描分析了其色素组成。结果发现与原始菌株相比,7株转化子的总色价都有所降低,其中有3株转化子水溶性色素和醇溶性色素都多了一个吸收峰;有1株转化子的仅醇溶性色素多了一个吸收峰。