论文部分内容阅读
茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是一种叶用经济作物,茶树花芽和叶芽共同着生于叶腋间,从花芽开始分化到果实成熟历经15-16个月,在这个过程中,漫长的生殖生长对叶片的营养生长必然产生竞争作用。因此,缩短茶树的生殖生长周期促进叶芽的营养生长,是解决当前茶叶生产所面临重大难题的方法之一。花发育过程非常复杂,需要一系列基因共同调控完成。根据植物开花过程基因的作用阶段将其分为:开花时间相关基因、花分生组织特征基因以及花器官特征基因。其中AP1、FUL和AGL6基因既属于花分生组织特异基因又属于花器官特征基因,花发育早期,三者都可以促使花序分生组织向花分生组织转变,在成花转变过程中起重要调控作用;花发育后期,它们调控不同花器官的发育。为了揭示茶树花发育和果实发育过程中这些基因的作用,有必要克隆茶树CsAP1、CsFUL和CsAGL6基因并研究其功能,阐释茶树成花转变过程的分子调控机制,为进一步利用分子生物学手段缩短茶树花期提供理论依据。本研究以陕西省紫阳群体种中的代表种质“紫阳槠叶种”(Camelliasine.siscv.Ziyangzhong)为材料,通过同源克隆和RT-PCR方法从茶树分化的花芽中成功获得茶树CsFUL和CsAGL6基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析和系统进化分析,从3方面对其进行功能分析,首先,利用35s启动子异位表达拟南芥分析CsAP1、CsFUL和CsAGL6基因的功能;其次,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)解析它们的表达模式;最后,利用亚细胞定位、酵母单杂交技术和酵母双杂交技术初步确定这3个转录因子的互作情况,以阐明这3个基因在茶树成花转变和花发育过程中的作用。主要结论有:1.以“紫阳槠叶种”分化的花芽为实验材料,通过同源克隆和RT-PCR方法,成功获得了 2个长度分别为735 bp和726 bp的cDNA序列,通过BLASTN比对和系统进化分析发现,这2个茶树基因与GenBank数据库中的山茶(Camelliia japonica)、，猕猴桃(Actinidia chinensis)、牵牛(Ipomoea mil)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种的FUL和AGL6同源基因相似,都具有较保守的MADS结构域和K域以及特征基序,因此分别命名为CsFUL和CsAGL6,GeneBank登陆号为KU862280 和 KU862281。2.对CsFUL和CsAGL6编码的蛋白进行生物信息学与系统进化分析发现:CsFUL和CsAGL6基因分别属于AP1/FUL-like家族和AGL6-like家族,编码MIKC型MADS-box转录因子。2个转录因子均有较为保守的特征基序,即CsFUL蛋白的基序为 MPPWMI;CsAGL6 蛋白有两个基序 DNETVLQIGY(AGL6-Ⅰ motif)和GWVL(AGL6-Ⅱ motif),转录因子C端特征基序使该家族蛋白形成相似的高级结构从而赋予其特定类似功能。3.定量PCR结果可知,CsAP1基因主要在萼片和花瓣中表达,CsFUL基因在花芽、幼叶和果实中表达量较高,CsAGL6基因在四轮花器官均有表达,在萼片、花瓣和心皮中具有高表达趋势。CsAP1符合典型ABC模型中A类基因的表达模式,而CsFUL却有其独特的功能,调控花原基的分化、幼叶和果实的的发育。基因CsAGL6参与调控四轮花器官的正常发育。此外,三个基因在果实组织中高表达,推测这3个基因可能共同调控茶树果实的发育。4.异位表达拟南芥结果显示,35s::CsAP1、35s::CsFUL和35s::CsAGL6转基因植株均有提前开花现象,花期提前一周左右,提早进入生殖生长阶段导致转基因苗矮小,叶片小。35s::CsAP1转基因植株的顶端花序产生由两朵花融合为一朵末端花,花瓣由4枚变为5枚;侧生花序变为单花,表明基因CsAP1在花序分生组织向花原基分化过程中具有一定调控作用,同时还参与萼片和花瓣的发育。35s::CsFUL转基因拟南芥的莲座叶和茎生叶卷曲,说明CsFUL基因在叶片发育中有一定作用。而35s::CsAGL6转基因苗除了早花,植株矮小,无其他表型变化。5.亚细胞定位和酵母单杂交实验表明,转录因子CsAP1、CsFUL和CsAGL6主要定位于洋葱细胞核,每个蛋白均单独不具备转录激活活性,酵母双杂交实验进一步表明,在特定的时空下,蛋白CsAP1、CsFUL和CsAGL6可以互相形成异源复合物,即两两之间发生相互作用。这预示着茶树CsAP1、CsFUL和CsAGL6可能在其他蛋白的帮助下,产生转录激活活性,进而结合于靶标基因,参与茶树成花转变和花器官的发育。