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血管重塑(vascular remodeling)是血管结构和功能对内环境改变发生的代偿性反应,包括血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化、增殖、迁移以及细胞外基质(ECM)合成与降解,如果血管重塑的诱发因素长期存在,则是由于VSMC异常增殖及大量合成ECM而导致。血管新生内膜增厚和管腔狭窄,成为高血压、动脉粥样硬化斑块形成和经皮冠状动脉球囊成形术(PTCA)后再狭窄的病理特征之一。因此研究VSMC增殖的分子机制及有效防治药物,对血管重塑性疾病的防治具有重要意义。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II),作为肾素血管紧张素醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的主要肽类激素,可诱导VSMC增殖和迁移,虽然近年对Ang II诱导血管重塑的作用机制进行了大量研究,然而其刺激VSMC增殖的分子机制还不是十分清楚。MicroRNA(miRNA)通过与靶mRNA的3’-非翻译区(UTR)结合而对基因表达在转录后水平上进行调控,其表达异常与多种疾病,包括心血管疾病的发生发展紧密相关。miR-146a作为miR-146家族成员之一,既往研究表明,miR-146a在血管新生内膜中表达上调,提示其可能参与VSMC增殖过程,但miR-146a和Ang II在VSMC增殖调节中的相互关系尚有待阐明。丹参酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)是从活血化瘀经典中药丹参的根及根茎中提取的水溶性有效成分,属于酚酸类化合物,具有降低心肌缺血再灌注损伤、抗心肌细胞损伤、保护血管内皮细胞、抑制VSMC增殖及防治动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种作用。然而Sal B抑制VSMC增殖的分子机制及其与miR-146a之间的关系尚未见报道。目的:建立Ang II诱导的小鼠VSMC增殖模型,探讨miR-146a在VSMC增殖中的作用,研究Sal B抑制VSMC增殖与miR-146a表达之间的关系,为丹参通过活血化瘀抑制VSMC增殖及防治血管重塑提供新的理论依据。方法:1体外培养小鼠VSMC,用不同浓度Ang II处理VSMC不同时间,来确定Ang II诱导VSMC增殖的最适浓度和作用时间。Quantitative real time PCR(qRT-PCR)检测分析miR-146a、PCNA、cyclin D1和KLF5 mRNA表达,Western blot检测分析PCNA、cyclin D1和KLF5蛋白水平,细胞计数和MTS检测细胞增殖活性。2分别用miR-146a模拟物(miR-146a mimic)和miR-146a抑制剂(miR-146a inhibitor)转染VSMC,之后给予Ang II刺激,Western blot检测PCNA、cyclin D1和KLF5蛋白表达,qRT-PCR检测PCNA、cyclin D1和KLF5 mRNA,细胞计数和MTS检测细胞增殖活性。3将C57BL/6小鼠随机分为对照组、结扎+miR-146a antagomir组和结扎+control antagomir组,采取苏木精-伊红染色(HE)检查血管内膜增生的形态学改变。4用Sal B预孵育小鼠VSMC后给予Ang II刺激,细胞计数和MTS检测细胞增殖,Western blot和qRT-PCR分析PCNA、cyclin D1和KLF5表达。qRT-PCR分析检测miR-146a表达。5将C57BL/6小鼠随机分为颈动脉结扎组、颈动脉结扎+生理盐水组、颈动脉结扎+Sal B组,HE染色评价血管内膜增生的形态学改变。结果:1.Ang II促进VSMC增殖及miR-146a表达。用Ang II刺激VSMC不同时间,miR-146a表达量显著上调,并具有时间依赖性。Western blot分析结果显示,Ang II能够促进增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(cyclin D1)以及KLF5的表达,qRT-PCR结果与Western blot结果一致。细胞计数与MTS结果也显示,给予Ang II刺激后VSMC增殖率显著增高。2.过表达和敲低miR-146a分别促进和抑制VSMC增殖用miR-146a mimic转染VSMC后:PCNA、cyclin D1和KLF5的表达量显著升高,细胞计数和细胞增殖率增加。相反,miR-146a inhibitor下调PCNA、cyclin D1和KLF5表达及抑制细胞增殖。这些结果表明,miR-146a通过诱导cyclin D1和KLF5表达而促进VSMC增殖。3.原位转染miR-146a抑制剂显著减少颈动脉结扎诱导的血管内膜增生。在颈动脉结扎后通过原位转染miR-146a antagomir或control antagomir敲低miR-146a表达,观察miR-146a在血管新生内膜形成中的的作用。HE染色结果显示,miR-146a拮抗剂显著抑制内膜增生,减少内膜中膜比值(I/M)和新生内膜面积。4.Sal B通过下调miR-146a表达抑制Ang II诱导的VSMC增殖。用Sal B预孵育VSMC后再给予Ang II刺激,细胞计数和细胞增殖率显著减少。Western blot和qRT-PCR分析结果显示,用Sal B预孵育后,Ang II诱导的PCNA、cyclin D1和KLF5表达受到显著抑制。同时,Sal B能够抑制Ang II诱导的miR-146a表达。这些结果表明,Sal B通过下调miR-146a表达而抑制Ang II诱导的VSMC增殖。5.Sal B抑制小鼠颈动脉结扎诱导的血管内膜增生。HE染色结果表明,腹腔注射Sal B能够显著抑制颈动脉结扎诱导的血管内膜增生,减少I/M比值及新生内膜面积。结论:1.Ang II促进VSMC增殖及miR-146a表达。2.miR-146a通过上调cyclin D1及KLF5表达,促进VSMC增殖。3.Ang II通过上调miR-146a表达诱导的VSMC增殖。4.miR-146a促进血管结扎诱导的颈动脉内膜增生。5.Sal B通过下调miR-146a表达而抑制Ang II诱导的VSMC增殖和颈动脉结扎引起的血管内膜增生。