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恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一,但理想的治疗方案仍是一个世界性难题,近年来将纳秒级陡脉冲诱导肿瘤细胞凋亡作用用于肿瘤病变的治疗,展现出令人振奋的临床应用前景。研究表明,当电场脉宽降低至纳秒(ns)级,电场强度升高至几十kV/cm时,细胞内部出现一系列功能及结构改变,这种现象称为细胞内电处理效应(Intracellular Electromanipulation, IEM)[1,2],其中纳秒级陡脉冲诱导肿瘤细胞发生程序性死亡(Programmed death),即凋亡(Apoptosis),是IEM的研究重点。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下,遵循自己的程序结束生命的过程,线粒体在细胞凋亡的信号转导通路中起着关键的作用[3]。本实验从线粒体凋亡途径着手,以人卵巢癌浆液性囊腺SKOV3细胞为实验对象,进一步研究纳秒级陡脉冲对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。实验共分两部份:1、纳秒级陡脉冲对SKOV3细胞凋亡诱导作用及最佳陡脉冲参数确定;2、纳秒级陡脉冲诱导SKOV3细胞凋亡过程中线粒体功能及凋亡相关分子表达的改变。1纳秒级陡脉冲对SKOV3细胞凋亡诱导作用及最佳陡脉冲参数确定1.1材料与方法1.1.1以场强为50KV/cm,脉宽分别为50ns、100ns、200ns,脉冲个数分别为10、30、60、80的陡脉冲处理的SKOV3细胞为实验组,以未经处理的SKOV3细胞为对照,应用AnnexinV/PI双染,流式细胞仪法检测早期凋亡率;琼脂糖凝胶电泳法检测分别孵育6h后处理组及对照组的DNA ladder。1.1.2以50kV/cm,100ns,30个脉冲电场处理SKOV3细胞,分别孵育30min、2h、6h、12h后提取总蛋白,western blot法检测Caspase-3活性片段。1.2结果1.2.1与对照组相比,纳秒陡脉冲处理组AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测结果显示脉宽低于100ns时,以AnnexinV~+/PI~-为主,即磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,细胞膜保持完整,提示脉冲电场对SKOV3细胞的作用以内处理效应为主;脉宽为200ns时,以AnnexinV+/PI+为主,PI穿透细胞膜进入胞核,即细胞膜破裂,提示脉冲电场对SKOV3细胞的作用以电穿孔作用为主。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示脉宽50ns、100ns的纳秒级陡脉冲处理组有大量DNA ladder形成,提示SKOV3细胞发生凋亡;而200ns处理组条带膜糊没有明显的DNA ladder形成,提示SKOV3细胞发生坏死。1.2.2与对照组相比,处理组SKOV3细胞内Caspase-3活性片段表达量显著增加(P﹤0.05)。1.3结论纳秒级陡脉冲对细胞的内处理作用能诱导离体SKOV3细胞凋亡,其最佳脉宽50～100ns,最低场强约50kV/cm,在一定脉冲数量内,凋亡率随脉冲个数增加而升高,继续增加脉冲个数,细胞凋亡率下降,死亡率增加。2纳秒级陡脉冲诱导SKOV3细胞凋亡过程中线粒体功能及凋亡相关分子表达的改变。2.1材料与方法2.1.1 50kV/cm,100ns,30个陡脉冲处理SKOV3细胞,分别孵育30min、2h、6h、12h后于处理组和对照组装载入活性氧荧光探针DCFH-DA,流式细胞仪检测不同时间段SKOV3细胞线粒体活性氧(ROS)变化。2.1.2 50kV/cm,100ns,30个陡脉冲处理SKOV3细胞,分别孵育30min、2h、6h、12h后于处理组和对照组装载入膜电位荧光探针JC-1,流式细胞仪检测线粒体膜电位(△Ψ_m)变化。2.1.3 50KV/cm,100ns,30个陡脉冲处理SKOV3细胞,免疫荧光检测孵育6h后处理组与对照组线粒体膜间隙蛋白Cyt-C、AIF分布的变化;Western blotting法检测分别孵育30min、2h、6h、12h后处理组与对照组SKOV3细胞胞浆内Cyt-C、AIF表达量变化。2.1.4 50KV/cm,100ns,30个陡脉冲处理的SKOV3细胞,western blot法检测凋亡调控蛋白Bax、Bcl-2表达量的改变。2.2结果2.2.1与对照组相比,经纳秒级陡脉冲处理后的SKOV3细胞,细胞内ROS荧光强度立刻升高(P﹤0.05),随时间的延长,荧光强度减弱,12h后荧光强度低于对照组。2.2.2与对照组相比,经纳秒级陡脉冲处理后的SKOV3细胞,2h△Ψm开始降低,6h降至最低(P﹤0.05),持续至12h△Ψ_m仍低于对照组(P﹤0.05)。2.2.3与对照组相比,经纳秒级陡脉冲处理后的SKOV3细胞, Cyt-C、AIF由线粒体膜间隙释放分别定位于胞浆、胞核,细胞胞浆内Cyt-C、AIF表达量增加(P﹤0.05)。2.2.4与对照组相比,经纳秒级陡脉冲处理后的SKOV3细胞,促凋亡蛋白Bax表达量显著增加(P﹤0.05),抑制凋亡蛋白Bcl-2表达量略降低(P﹥0.05),但Bcl-2/Bax显著减小(P﹤0.05)。2.3结论纳秒级陡脉冲诱导SKOV3细胞凋亡过程中,线粒体的功能及凋亡相关分子的表达发生改变,线粒体可能在纳秒级陡脉冲诱导细胞凋亡中起重要作用。